农杆菌介导家稗丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）基因小麦转化体系优化的研究

摘要

对受体基因型敏感性的依赖，制约农杆菌介导小麦受体材料的获取范围，外植体材料获取途径的单一，限制了受体材料的获取数量，现有小麦转化体系不具备通用性，造成农杆菌介导小麦转化的低效率。低效率导致小麦基因转化滞后于其他作物。为实现对小麦基因组的C4改造，提高小麦的光合效率，必须突破外植体取材限制，提高小麦的转化效率。本研究以扩大外植体数量，鉴定敏感型受体小麦品种为研究基础，针对限制小麦转化效率的因素:受体因素、载体类型、侵染因素、分化因素、随机因素，通过统计Gus基因的表达，鉴定各限制因素的最高表达效率，确定体系优化条件，提高转化效率，获得转化植株，初步建立一套成熟胚愈伤、幼胚愈伤相结合的高效、通用的转化程序。 结果如下: 1)济麦21、山东01-35、邯郸3475、师栾02-l、晋57的成熟胚诱导愈伤的成愈率在60％以上，可增加成熟胚的诱导基数提高外植体数，诱导外植体作为优化体系材料；14个幼胚材料的成愈率在85％以上，可作为主要转化材料。 2)对农杆菌侵染毒力鉴定，农杆菌株系C58c1的毒力水平适宜侵染。对34个成熟胚及14个幼胚的愈伤组织侵染转化，扬麦10、扬麦158、师栾02-1、石家庄5号、周麦18、山东01-35、泰山008、Y9-63、邯郸3475的转化植株经。PCR检测，丙酮酸磷酸二激酶基因、hpt因能够表达，为敏感型受体小麦材料；幼胚愈伤组织扬麦10、扬麦158、成熟胚愈伤师栾02-1,Gus基因能够表达，且恢复培养14d，Gus基因的表达效果较好，为体系优化材料； 3)以扬麦10、扬麦158、师栾02-1为材料的转丙酮酸磷酸二激酶转化体系中，预培养60d的扬麦158，调节菌液浓度OD600 0.6-0.8，侵染40一50min，再生愈伤率和Gus基因表达率最高；预培养60d的扬麦10，菌液浓度OD600 0.5-0.7，侵染30-40min，再生愈伤率和6us基因表达率最高；预培养180d以上的师栾02-1，调节菌液浓度OD600 0.4-0.6，侵染20-30min，再生愈伤率和Gus基因表达率最高。以无菌滤纸为缓冲介质，可提高6us基因表达。不附加任何激素的MS培养基绿点分化快。附加NAA1mg/L、6-BA 0.2 mg/L。的培养基中能促进绿点形成芽点，抑制不定根的发育:对低营养水平、低生长素浓度，促进芽点分化生根。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1立题意义

1.2 C3植物C4化改造原理

1.2.1 C3、C4植物光合原理

1.2.2 C4关键酶基因

1.2.3丙酮酸磷酸二激酶基因研究进展

1.2.4 PPDK基因的生理作用

1.2.5 C3植物C4化改造中可能出现的问题

1.3农杆菌介导的植物基因转化研究进展

1.3.1农杆菌转化的基本原理

1.3.2植物农杆菌转化的发展

1.3.3农杆菌介导小麦转化存在的问题

1.4本研究的目标与内容

2材料与方法

2.1载体构建

2.2试验受体小麦的选择

2.3仪器与试剂

2.4外植体的选择以及培养

2.5转化方法及转化鉴定

2.5.1工程菌液的制备

2.5.2愈伤组织的侵染及恢复

2.5.3筛选及分化

2.5.4转化体Gus检测鉴定

2.5.5 PCR检测

2.5.6转化植株的Southern分析

3结果与分析

3.1敏感型受体的鉴定及PPDK小麦转化系的优化

3.1.1不同外植体诱导愈伤组织的成愈率

3.1.2不同株系的农杆菌对转化的影响

3.1.3受体材料的敏感性鉴定

3.4不同的工程菌液浓度对转化率的影响

3.1.5不同的侵染时间对转化效率的影响

3.1.6共培养缓冲介质对转化效率的影响

3.1.7愈伤的预培养时间对转化效率的影响

3.1.8愈伤大小对转化效率的影响

3.1.9激素的类型及浓度对转化效率的影响

3.1.10芽点诱导分化激素类型及浓度的影响

3.1.11根的诱导对转化效率的影响

3.1.12 Hyg筛选浓度及筛选方式对转化效率的影响

3.2转基因小麦的PCR检测

3.2.1 Hyg基因的PCR检测

3.2.2 PPDK基因的PCR检测

3.3 Southern杂交分析

4讨论与结论

4.1讨论

4.1.1外植体的获取途径及受体材料的敏感性

4.1.2农杆菌介导高效小麦转化体系的优化

4.2结论

4.2.1敏感小麦基因型的鉴定与外植体获取途径

4.2.2农杆菌介导丙酮酸磷酸二激酶体系的优化及转化体系流程初步建立

参考文献

附录

作者简介

致谢