玉米大斑病菌cAMP依赖性蛋白激酶A基因的克隆与功能分析

摘要

玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）是玉米上的一种重要丝状病原真菌，引起的玉米大斑病（Northern Leaf Blight of Corn，简称NCLB）是威胁玉米生产的一种重要的叶部病害。研究表明，cAMP信号转导途径在病菌的生长发育和致病过程中发挥重要作用，蛋白激酶A是该途径下游的主要效应分子。本研究首先利用抑制剂试验初步确定了基因的功能，应用候选基因法和Genome Walking技术克隆了玉米大斑病菌的cAMP依赖性蛋白激酶A调节亚基基因（PKA-R）全长序列和催化亚基基因（PKA-C）同源片段，并对其进行了生物信息学分析、基因缺失突变体分析等方面的研究，为进一步明确cAMP信号转导途径在玉米大斑病菌致病过程中的作用提供了理论依据。
　　 本文利用PKA特异性抑制剂H89处理玉米大斑病菌孢悬液，结果发现分生孢子的萌发和附着胞的形成均受到抑制。H89随着浓度的增加，对孢子萌发和附着胞形成的抑制作用明显增强；同一浓度下，抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发过程。初步确定了PKA在病菌分生孢子萌发和附着胞的形成过程中起重要作用。
　　 根据已知植物病原真菌PKA-R和PKA-C基因的保守核苷酸序列设计简并性引物，以玉米大斑病菌基因组DNA为模板，扩增获得了PKA-R和PKA-C基因的同源片段。利用Genome Walking技术对所得的基因片段进行延伸，获得了2688 bp的PKA-R基因全长序列和1382 bp的PKA-C基因片段。Southern杂交技术确定了PKA-R基因和PKA-C基因在玉米大斑病菌基因组中均以单拷贝形式存在。
　　 生物信息学分析表明，PKA-C基因编码氨基酸序列与烟草赤星病菌（Alternaria alternata）、小麦颖枯病菌（Phaeosphaeria nodorum）、小麦黄斑叶枯病菌（Pyrenophora tritici-repentis）等病原菌的PKA-C蛋白同源性达69％～85％；比对PKA-R基因DNA和cDNA序列发现，该基因没有内含子，开放阅读框为1398 bp，编码465个氨基酸残基；蛋白的分子量约为50.437 kD，等电点pI5.68，编码蛋白与小麦黄斑叶枯病菌（P.Tritici-repentis）、小麦颖枯病菌（P.Nodorum）、灰霉病菌（Botryotinia fuckeliana）等病原菌的PKA-R蛋白同源性达58％～88％。PKA-R蛋白为亲水性细胞质蛋白，没有预测到信号肽和跨膜结构，二级结构预测表明，PKA-R蛋白由α-螺旋（34.84％）、β-折叠（13.55％）、β-转角（4.52％）和随机卷曲（47.10％）组成。
　　 为进一步研究基因功能，试验构建了PKA-R基因的双交换同源重组型基因敲除载体及PKA-C基因的RNA干扰载体。对PKA-C基因的RNA干扰载体质粒利用PEG介导法转化玉米大斑病菌的原生质体，潮霉素筛选共获得了11个转化子。以潮霉素磷酸转移酶基因hph为探针，经Southern杂交验证，确定了转化子m5-1为突变体。对突变体m5-1进行表型分析，发现其生长速率降低，菌丝节间变短，且不产生分生孢子。

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1 引 言

2 材料和方法

3 结果与分析

4 讨 论

5 结 论

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