AtEFS1基因在拟南芥开花调控途径中的功能分析

摘要

研究植物开花时间调控的分子机制对于调节植物繁殖和发育、提高作物产量和品质具有重大的意义。实验室前期研究从拟南芥T-DNA插入突变体库中筛选获得了一株早花突变体efs-1(early flowering in short mutant1),通过Genome Walking技术和生物信息学方法鉴定出一个新的拟南芥开花调控相关基因EFS1,通过互补回复和超表达试验,确定了EFS1基因为拟南芥开花调控基因,利用RT-PCR和Real-Time PCR技术,初步确定了EFS1基因可能通过GA、春化和光周期途径调控拟南芥开花。为进一步明确EFS1基因在拟南芥开花调控途径中的功能,本试验利用反义RNA和RNAi技术,获得EFS1基因功能缺失突变体,验证了EFS1基因的功能；通过检测春化,赤霉素对花期和EFS1基因表达的影响,初步确定EFS1基因参与的拟南芥开花调控途径；通过构建及获得并鉴定开花关键基因的超表达、T-DNA插入突变体,为进一步明确EFS1基因所参与的拟南芥开花调控途径及在途径中的位置奠定基础。
　　 1.春化和赤霉素处理拟南芥野生型、efs-1突变体、回复及超表达突变体,通过分析春化和赤霉素处理对花期及EFS1基因表达的影响,初步确定了EFS1基因主要通过光周期途径和赤霉素途径控制着植物的成花。
　　 2.构建了EFS1基因反义RNA和RNAi载体pCAMBIA1300-EFS1A和pCAMBIA1300-EFS1i,经农杆菌介导转化拟南芥突变体efs-1,通过潮霉素筛选和PCR鉴定,获得了11株RNAi转基因植株和10株反义RNA转基因植株。RT-PCR分析发现,转基因植株中EFS1基因的表达均受到不同程度的抑制,确定所得转基因植株均为EFS1基因的(反义RNA／RNAi)功能缺失突变体。对野生型和各种突变体植株的表型进行观察,进一步确定了EFS1基因缺失导致植株早花。
　　 3.构建了开花途径中关键基因CO租FLC的超表达载体pCAMBIA1300-CO和pCAMBIA1300-FLC,经农杆菌介导转化拟南芥野生型Col-0。通过潮霉素筛选及PCR和RT-PCR鉴定,获得9株CO超表达转基因植株和8株FLC超表达转基因植株。
　　 4.从拟南芥SALK库中获得了拟南芥开花途径中关键基因GI、CO、LHY、FVE及EFS1的T-DNA插入突变体(SALK092757、CS870084、SALK149287、SALK027724(CS878321)和SAIL_122_H09)。利用PCR技术,获得了GI、CO、LHY、FVE及EFS1基因的纯合突变体。
　　 5.构建了EFS1基因的酵母诱饵表达载体pAS1-EFS-CDS,为进一步筛选EFS1的互作蛋白奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

缩写词表

1 引言

2 材料和方法

2.1 试验材料

2.1.1 供试植物和菌株

2.1.2 供试试剂

2.1.3 供试培养基、营养液和转化介质的配备

2.1.4 主要仪器和设备

2.2 春化、赤霉素处理对花期及EFS1基因表达的影响

2.2.1 春化、赤霉素处理

2.2.2 开花时间统计

2.2.3 EFS1基因的表达分析

2.3 EFS1基因功能验证

2.3.1 EFS1基因反义表达载体的构建

2.3.2 EFS1基因RNAi表达载体的构建

2.3.3 农杆菌的转化

2.3.4 拟南芥遗传转化

2.3.5 阳性苗的筛选

2.3.6 转基因植株的PCR鉴定

2.3.7 转基因植株的RT-PCR分析

2.3.8 转基因植株的花期分析

2.4 CO、FLC超表达突变体的获得

2.4.1 CO基因表达载体的构建

2.4.2 FLC基因表达载体的构建

2.4.3 农杆菌的转化

2.4.4 拟南芥遗传转化

2.4.5 转基因阳性苗筛选

2.4.6 转基因植株的PCR鉴定转基因植株的RT-PCR分析

2.4.7 转基因植株的花期分析

2.5 GI、CO、LHY、FVE及EFS1突变体的纯合鉴定

2.5.1 拟南芥基因组DNA的提取

2.5.2 引物设计

2.5.3 PCR反应

2.6 EFS1基因酵母诱饵表达载体pAS1--EFS-CDS的构建

2.6.1 EFS-CDS基因片段的克隆

2.6.2 pAS1载体制备

2.6.3 EFS-CDS基因片段的制备

2.6.4 pAS1--EFS-CDS载体的构建

3 结果与分析

3.1 春化、赤霉素处理对花期及EFS1基因表达的影响

3.1.1 春化、赤霉素处理对花期的影响

3.1.2 春化、赤霉素处理对EFS1基因表达的影响

3.2 EFS1基因的功能验证

3.2.1 EFS1基因的反义表达载体构建

3.2.2 EFS1基因RNAi表达载体的构建

3.2.3 抗性转基因植株的获得

3.2.4 转基因植株的PCR鉴定

3.2.5 转基因植株的RT-PCR分析

3.2.6 转基因植株的花期分析

3.3 CO、FLC基因超表达突变体的获得

3.3.1 CO基因的超表达载体构建

3.3.2 FLC基因的超表达载体构建

3.3.3 抗性转基因植株的获得

3.3.4 转基因植株的PCR鉴定

3.3.5 转基因植株的RT-PCR分析

3.3.6 转基因植株的花期分析

3.4 GI CO、LHY、FVE及EFS1突变体纯合的验证

3.5 诱饵表达载体pAS1-EFS-CDS的构建

3.5.1 EFS-CDS基因片段的扩增

3.5.2 诱饵表达载体构建

4 讨论

4.1 RNAi和反义RNA技术

4.2 EFS1基因的功能

4.3 EFS1基因所参与的开花调控途径

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢

附件