不同被毛密度獭兔皮肤组织的差异表达基因筛选和CCNA2基因的多态性检测及其与被毛密度的相关性研究

摘要

獭兔(力克斯兔)是一种典型的裘皮用兔,评价獭兔毛皮品质的主要指标有被毛密度、被毛长度、粗毛率、绒毛细度和皮张面积,而目前我国獭兔毛皮品质方面存在的问题主要集中在被毛密度及皮张面积上。如何提高我国獭兔的毛皮品质以提高市场竞争力,是目前亟待解决的问题。
　　 本研究以獭兔为研究对象,利用基因芯片技术,对不同被毛密度獭兔的皮肤组织中差异表达的基因进行筛选,并采用实时定量PCR方法对芯片结果进行验证；采用RT-PCR方法克隆獭兔的CCNA2基因序列,通过测序结合PCR-RFLP技术对獭兔CCNA2基因进行单核苷酸多态性检测,并探讨其与獭兔毛皮品质特别是被毛密度的关系,旨在为獭兔分子标记辅助选择提供有效的遗传标记。
　　 研究结果如下:
　　 (1)利用家兔全基因表达谱芯片筛选出了2657个在不同被毛密度獭兔皮肤组织间差异表达的基因,其中包含1106个已知功能的基因,表达上调的基因687个,表达下调的基因419个。GO分类显示:大部分差异表达的基因位于细胞膜、细胞融入膜或细胞融入质膜；属于核苷酸、蛋白质、DNA及离子结合类分子；主要涉及细胞信号转导,发育以及细胞增殖、分化、凋亡等。KEGG信号通路分析显示:在表达上调的基因中95个通路功能状态发生的改变有统计学意义(P<0.05),涉及细胞粘附分子、TGFβ、MAPK、Wnt信号通路等；在表达下调的基因中87个通路功能状态发生的改变有统计学意义(P<0.05),涉及细胞周期、氧化磷酸化、p53信号通路等。实时定量PCR结果与基因芯片结果基本吻合,证实基因芯片结果可靠。
　　 (2)通过基因芯片试验,很多与细胞增殖、分化、凋亡、细胞信号转导等有关的基因被筛选出来,如:MMP2、TGFβ1、TGFβ2、IGF-1B、BMP2、ActRⅡ B、CDK2、CCNA2等,这些基因的差异表达,可能参与皮肤毛囊的形成或分化过程,最终导致獭兔被毛密度的差异。结合多方面的分析结果,最终选定细胞周期素A2(CCNA2)基因作为后续试验的候选基因。
　　 (3)通过RT-PCR方法克隆出了獭兔的CCNA2基因序列。通过测序结合PCR-RFLP技术检测出了CCNA2基因的两个SNPs位点:129G>A位点引起了限制性核酸内切酶位点ScaⅠ的变化,是丙氨酸的同义突变；1140G>C位点引起了限制性核酸内切酶位点AflⅡ的变化,是从赖氨酸到天冬酰胺的错义突变。
　　 (4)在试验兔群中,CCNA2基因的129G>A位点的G等位基因为优势基因,GG型的基因型频率高于AA型的基因型频率；1140G>C位点的G等位基因为优势基因,GG型的基因型频率高于CC型的基因型频率。这两个位点均处于中度多态(0.250.05)。
　　 (5)对獭兔的CCNA2基因多态性和毛皮品质相关性分析表明,129G>A位点的GG基因型的背中部被毛密度显著高于GA型和AA型；1140G>C位点的GG基因型的背中部被毛密度显著高于GC型和CC型；CCNA2基因129G>A位点和1140G>C位点的GG基因型均能在不影响獭兔皮张面积、被毛长度和绒毛细度的情况下,显著增加其被毛密度。可以将其作为影响獭兔毛皮品质特别是被毛密度的分子标记。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

1.1 獭兔生产概括

1.1.1 獭兔的起源与发展

1.1.2 我国獭兔养殖现状

1.1.3 獭兔产毛性能评价

1.1.4 獭兔毛皮品质在分子水平上的研究现状

1.2 筛选差异表达基因的研究方法

1.2.1 基因水平筛选差异基因

1.2.2 蛋白质水平筛选差异基因

1.3 基因芯片概述

1.3.1 基因芯片的概念

1.3.2 基因芯片的分类

1.3.3 基因芯片的设计

1.3.4 基因芯片的制备

1.3.5 基因芯片实验的过程

1.3.6 基因芯片数据处理

1.3.7 基因芯片的优点

1.3.8 基因芯片技术的应用

1.3.9 基因芯片技术存在的问题及发展前景

1.4 育种方法

1.4.1 常规育种方法

1.4.2 数量遗传学选择育种

1.4.3 分子标记育种方法

1.5 分子遗传标记概述

1.5.1 分子遗传标记的概念

1.5.2 理想的分子标记的界定

1.5.3 分子遗传标记方法

1.6 本研究的目的和意义

2 研究一 不同被毛密度獭兔皮肤组织差异表达基因的筛选

2.1 实验材料

2.1.1 獭兔皮肤组织样品的采集

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 溶液配制

2.2 试验方法

2.2.1 RNA的提取和纯化

2.2.2 探针制备和荧光标记

2.2.3 芯片杂交与洗片

2.2.4 芯片扫描

2.2.5 芯片数据分析

2.2.6 实时定量PCR验证

2.3 结果与分析

2.3.1 总RNA质量检测结果

2.3.2 基因芯片杂交结果

2.3.3 差异表达基因GO分类结果

2.3.4 差异表达基冈KEGG分析结果

2.3.5 实时定量PCR验证结果

2.4 讨论

2.4.1 关于试验设计

2.4.2 关于基因芯片数据分析方法

2.4.3 关于差异表达基因

2.4.4 荧光定量PCR验证基因芯片结果

2.4.5 关于候选基因的选择

2.5 小结

3 研究二 CCNA2基因的多态性检测及其与被毛密度的相关性研究

3.1 实验材料

3.1.1 獭兔血液样品的采集

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.1.4 溶液配制

3.2 试验方法

3.2.1 引物的设计与合成

3.2.2 RNA的提取和纯化

3.2.3 反转录合成cDNA

3.2.4 PCR扩增CCNA2基因

3.2.5 PCR产物的凝胶回收纯化

3.2.6 PCR产物的克隆

3.2.7 阳性重组子的鉴定

3.2.8 DNA测序及序列分析

3.2.9 PCR-RFLP 分析

3.2.10统计分析

3.3 结果与分析

3.3.1 总RNA质量检测结果

3.3.2 CCNA2基因的PCR扩增

3.3.3 PCR方法筛选阳性克隆

3.3.4 CCNA2基因测序结果

3.3.5 CCNA2基因PCR-RFLP多态性检测结果

3.3.6 CCNA2基因多态位点的遗传学分析

3.3.7 CCNA2基因对獭兔毛皮品质的影响

3.4 讨论

3.4.1 样本量的确定

3.4.2 关于SNPs研究

3.4.3 PCR-RFLP影响因素分析

3.4.4 关于遗传学分析

3.4.5 对毛皮品质进行标记辅助选择的可行性分析

3.4.6 本研究的下一步工作

3.5 小结

4 结论

参考文献

在读期间发表论文

附件

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致谢