双重PCR和竞争性PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系建立

摘要

马铃薯是世界上仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物,我国为世界第一大马铃薯生产国。马铃薯环腐病(Clavibacter michiganensis subsp.Sepedonicus,Cms)和黑胫病(Pectobacterium atroseptica,Eca)是影响马铃薯生产的两个重要的种薯传播细菌性病害,能够快速、准确、灵敏、可靠地检测这两种病害对降低种薯带菌减轻病害发生具有重要意义。本研究建立了双重PCR检测黑胫病菌和环腐病菌技术和竞争性PCR定量检测黑胫病菌技术。
　　 主要研究结果如下:
　　 1.根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原细菌的核苷酸序列,设计并合成了一对特异性引物CMS1／CMS2,利用引物CMS1／CMS2扩增出了一条913bp的马铃薯环腐病菌特异性条带,而马铃薯环腐病菌近缘种和马铃薯上的重要病原菌均未扩增出任何条带,特异性很高。检测灵敏度在DNA水平上达100fg／μL,在细菌数量上达105CFU／mL。
　　 2.将设计的引物CMS1／CMS2与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f／ECA2r结合,经过条件优化后,成功建立了双重PCR技术体系。利用该双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913bp和690bp的2条特异性条带,而15种对照菌株均未扩增出任何条带,检测灵敏度在DNA水平上达600fg／μL,在细菌数量上达5×105CFU／mL。应用该体系对患环腐病和(或)黑胫病的薯块进行了检测,能够检测到环腐病菌和(或)黑胫病菌的存在。实现了同时对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌的快速可靠检测。
　　 3.应用黑胫病菌特异性引物ECA1f／ECA2r扩增黑胫病菌DNA,将扩增产物克隆测序。根据扩增产物序列和引物ECA1f／ECA2r序列,设计了新引物ECA3f,与ECA2r组合扩增黑胫病菌DNA,制备竞争性模板。将竞争性模板插入。pEASY-T1克隆载体,导入Trans1-T1感受态细胞进行克隆操作,构建内参照菌(E.coli3f)。将已知数量的E.coli3f加入到含Eca的无菌水或马铃薯皮提取物中,通过比较马铃薯黑胫病菌与E.coli3f的扩增产物间的亮度比率能够估计马铃薯黑胫病菌的数量。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

1.1 马铃薯环腐病的识别与诊断

1.1.1 环腐病的症状与病原形态

1.1.2 革兰氏染色法鉴定

1.1.3 生理生化反应鉴定

1.1.4 茄子接种鉴定法

1.1.5 血清学鉴定

1.1.6 分子生物学技术检测马铃薯环腐病菌

1.2 马铃薯黑胫病的识别与诊断

1.2.1 黑胫病的症状与病原形态

1.2.2 血清学鉴定

1.2.3 分子生物学技术检测马铃薯黑胫病菌

1.3 双重PCR和竞争PCR在植物病原菌检测中的应用

1.3.1 双重PCR技术和竞争PCR技术及其原理

1.3.2 双重PCR和竞争PCR技术在植物病原菌检测中的应用

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料及仪器

2.1.1 供试菌株及来源

2.1.2 供试培养基及营养液

2.1.3 供试主要试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 双重PCR试验所用引物及出处

2.1.6 竞争性PCR试验所用引物及出处

2.2 试验方法

2.2.1 供试菌株的分离、纯化、培养和保存

2.2.2 DNA的提取

2.2.3 马铃薯苗的繁殖及其植株伤根接种

2.2.4 双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌

2.2.5 竞争性PCR定量检测马铃薯黑胫病菌

3 结果与分析

3.1 供试菌株的分离和纯化

3.1.1 马铃薯环腐病菌的分离和纯化

3.1.2 马铃薯黑胫病菌的分离、纯化和致病性测定

3.1.3 马铃薯田间土壤中细菌的分离、纯化和鉴定

3.2 双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌

3.2.1 引物CMS1/CMS2特异性检测

3.2.2 引物CMS1/CMS2灵敏性检测

3.2.3 双重PCR反应体系的建立

3.2.4 双重PCR检测环腐病菌和黑胫病菌侵染的薯块

3.3 竞争性PCR定量检测马铃薯黑胫病菌

3.3.1 马铃薯黑胫病菌特异性DNA序列的PCR反应及其产物克隆测序

3.3.2 PCR竞争性模板的制备和内参照菌的构建

3.3.3 无菌水稀释样品的竞争性定量PCR

3.3.4 模拟样品的竞争性定量PCR检测

4 讨论

4.1 马铃薯环腐病菌PCR检测的研究

4.2 双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌的研究

4.3 竞争性PCR定量检测马铃薯黑胫病菌的研究

5 结论

参考文献

附录1 缩写词表

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