玉米内生细菌的分离鉴定及抗真菌活性物质的研究

摘要

玉米大斑病是重要的玉米叶部病害之一,弓I起该病的病原菌为玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica),严重发生时会极大地影响玉米的产量和品质。目前防治大斑病主要是利用抗病品种,并辅以适当的药剂防治。但由于抗病品种的单一大面积应用往往导致抗性迅速丧失,化学药剂使用又常常带来严重的负面影响。因此,寻求新的病害防治途径势在必行。利用植物内生菌对植物病害进行生物防治具有臣大的发展潜力,本研究从健康玉米植株内分离得到22株内生细菌,进一步筛选得到1株对玉米大斑病菌具有拮抗作用的内生细菌YY1菌株,经对其生物学特性、抗菌性能、抗菌物质及抗菌机理进行分析与研究,获得以下主要结果:
　　 1.从健康玉米叶片中分离出的1株对玉米大斑病菌具有较好拮抗作用的内生细菌菌株-YY1,该菌株有较广的抗菌谱,通过分生孢子悬浮液喷雾法检测YY1菌株的生防效采,发现浓度为2×104个/mL的孢子悬浮液与YY1菌株发酵液等比例混合液,对玉米大斑病菌具有较好的抑制作用。通过形态观察,生理生化反应及16SrDNA基因序列比对,鉴定YY1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
　　 2.研究了YY1菌株的最佳发酵条件,即可溶性淀粉3.0％、蛋自胨2.0%、KH2PO40.02%、MnC120.01%,培养基初始pH9.0,培养基装液量30mL/250mL,接种量4%,28℃120rpm摇床振荡培养。研究发现,经发酵条件优化后,发酵液对玉米大斑病菌的抑菌活性在30h时几乎升高1倍。
　　 3.对YY1菌株分泌的抗菌蛋白粗提液的抑菌机理进行了初步研究,发现粗蛋白处理后致使玉米大斑病菌基内菌丝由丝状变为串珠状;当粗蛋白浓度为0.78μg/μL时,分生孢子萌发完全受抑制,原生质体裂解。孢子萌发和菌丝生长过程中,cAMP信号途径相关基因表达降低,且相关基因突变菌株抑制率亦降低,推测抑菌的分子机理可能与cAMP信号途径有关。
　　 4。抗菌粗蛋白对热稳定,对蛋白酶不敏感,重金属Cr3+可使蛋自完全失活,并且pH活性范围较宽,在pn6～11范围内抑菌活性强,在碱性条件下稳定,在强酸性条件下抑菌活性几乎消失。粗蛋白经分离纯化并进行SDS-PAGE检测得到单一蛋白条带YY1-0.3-6,分子量约为30kD,经MALDI-TOFMS分析发现该蛋白与烯酰辅酶A水解酶(enoyl-CoAhydratase)的匹配度最高。
　　 5.采用高速逆流色谱(HSCCC)对菌株YY1分泌的脂肽类抗菌物质进行分析,确定HSCCC最佳条件:检测波长为214nm,溶剂体系为乙酸乙酯:正丁醇:水(4:1:5)。经HSCCC后生测发现第9个组分对玉米大斑病菌有很强的抑菌活性,该组分的保留时问为113～115min,进一步经HPLC分析发现该组分成分不单一,组成较复杂,有待进一步分离鉴定。
　　 6.GFP标记YY1菌株,灌根法接种7d后,检测发现该菌株在玉米的根、茎、叶中均可检测到。说明菌株YY1在玉米体内可以传导并具有较强的定殖能力。