芦笋花药培养与再生植株性别分子标记鉴定

摘要

芦笋(Asparagusofficinalis.Linn)学名石刁柏,以嫩茎供食,具有极高的营养保健价值,有防癌、抗癌,预防和治疗高血压、心脏病等功效,是国际公认的抗癌食品,享有“蔬菜之王”的美誉。我国虽已成为世界芦笋生产与出口的大国,但我国芦笋生产用种主要依靠进口,缺乏自主知识产权的优良品种成为制约我国芦笋产业发展的瓶颈。芦笋是雌雄异株植物,性别由一对等位基因控制,雄性基因型为Mm,雌性基因型为mm,基因型为MM的雄株为超雄株。雄株具有生长旺盛、品质好、产量高、寿命长、抗病性强等特点,因此培育全雄品种成为国内外芦笋育种的主要方向,而培育全雄品种的关键是获得超雄株(MM)。花药培养是获得超雄株的简单且有效的途径。本试验以当前生产中表现较好的4个优良品种为试材,研究了季节、预处理、NAA及6-BA等因子,对芦笋花药培养形成愈伤组织的影响,建立了‘阿波罗’、‘冠军’以及‘NJ987’三个优良品种的花药培养技术体系,并利用分子标记技术对再生植株进行了性别鉴定。主要研究结果如下:
　　 1.芦笋花药培养愈伤组织的诱导:
　　 (1)季节影响芦笋花药愈伤组织的诱导,每年5月份采集的花药均能诱导形成愈伤组织,而7月与9月采集的花药未能诱导出愈伤组织。
　　 (2)当花蕾长度为1-2mm时,花药愈伤组织诱导率最高;花蕾长度为2-3mm、3-4mm时,愈伤组织诱导率降低;花蕾长度为4mm以上时,未能诱导出愈伤组织。
　　 (3)不同品种对低温预处理的要求不同,在4℃低温下,‘阿波罗’、‘冠军’和‘NJ987’花药处理5d,愈伤组织诱导率最高;而‘格兰蒂’花药处理3d,愈伤组织诱导率最高。
　　 (4)芦笋花药愈伤组织诱导形成的条件存在基因型差异,‘阿波罗’、‘冠军’和‘NJ987’在MS+2.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA条件下愈伤组织诱导率最高,且能自然分化成芽;而‘格兰蒂’在MS+2.0mg/L6-BA+1.25mg/LNAA,愈伤组织诱导率最高,但未分化成芽,对其愈伤组织进行再分化处理,未得到再生植株。
　　 2.‘阿波罗’、‘冠军’和‘NJ987’的再生植株最适继代增殖条件为:MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA。
　　 3.芦笋花药培养再生植株染色体倍性呈多样性。本试验对142株‘阿波罗’和341株‘NJ987’进行倍性鉴定,其中‘阿波罗’再生植株染色体数目为单倍体的占4.93％,二倍体占30.99%,三倍体占24.65%,四倍体占15.49%,非整倍体占23.94%;而‘NJ987’的再生植株染色体数目为单倍体的占2.64%,二倍体占78.89%,三倍体占7.04%,四倍体占4.99%,非整倍体占6.45%。
　　 4.芦笋再生植株性别的鉴定:
　　 (1)本试验优化了鉴定芦笋性别的STS标记体系,最佳PCR体系为20μL:总DNA提取液3μL,10×PCRBuffer(MgCl2)2μL,dNTP(2.5mM)0.8μL,TaqDNA酶(5U/μL)0.24μL,Asp1-T7-Pc(10U/μL)0.2μL,Asp1-T7-Ph(10U/μL)0.2μL,MgCl2(25mM)0.4μL,ddH2O13.16μL;反应程序为:94℃预变性30s;94℃变性30s,47℃退火30s,72℃延伸40s,32个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
　　 (2)本试验利用Aspl-T7标记对芦笋花药培养产生的370个再生单株进行了检测,其中251株在440bp附近扩增出特异片段,可确定为雄性株(MM、Mm、M)。其中‘阿波罗’品种的花药再生雄株为148株,‘NJ987’品种的花药再生雄株为103株。