拟南芥CPK10/CPK30双突变体的构建及基因功能的初步探讨

摘要

Ca2+作为植物信号转导途径中重要的第二信使，几乎介导了植物生长发育和对逆境响应的所有反应。CDPKs（或CPKs）即钙离子依赖的蛋白激酶，是一类重要的钙离子信号感受器，在响应逆境胁迫过程中发挥着重要的作用。拟南芥基因组共编码34个CDPKs，该家族成员具较高的序列同源性和典型的结构特征，可能存在功能相似或冗余的现象。
　　 实验室前期的工作表明，拟南芥CPK10基因的T-DNA插入突变体cpk0成苗阶段在干旱胁迫下表现出较野生型敏感的表型;而在种子萌发阶段和幼苗时期没有表现出明显逆境相关(ABA、Mannitol、Sorbitol)的生理表型。promoter::GUS组织表达分析显示CPK10在萌发两天的种子及生长十天的幼苗中有较强表达。CPK30与CPK10基因具有高度的序列相似性，推测其与CPK10可能存在功能相似或冗余的现象。为进一步研究CPK10在响应非生物逆境过程中的分子功能，我们拟通过构建cpk10×cpk30双突变纯合体，结合生理表型及逆境相关基因检测，进一步探讨CPK10可能的作用机制。
　　 本文构建了cpk10×cpk30双突变纯合体，并对双突变体在种子萌发时期、幼苗时期、成苗时期是否响应干旱、高盐、激素等非生物逆境胁迫过程进行了表型观察。在不同的逆境处理条件下，种子萌发和幼苗期均未发现双突变体表现出区别于野生型的明显表型;成苗期cpk10×cpk30双突变并未表现出比单突变体cpk10更加对干旱敏感的表型;盐处理结果显示，双突变体表现出较单突变体更敏感的表型。为进一步明确CPK10、CPK30可能参与的信号转导过程，通过选取响应非生物逆境不同信号途径(ABA合成、ABA信号等)的标记基因作为目的基因，通过分析双突变体、单突变体及野生型材料在干旱处理条件下，各标记基因转录水平表达量变化，探讨CPK10基因响应干旱逆境胁迫过程中发挥功能的分子机制。试验结果显示，RD29A表现出完全不同于野生型及单突变体的表达趋势变化，表明CPK10/CPK30与水分胁迫响应相关。ABA刺激响应蛋白激酶OST1的变化趋势在野生型、单突变体与双突变体中也存在明显的差异。根据以上结果，推断CPK10与CPK30可能共同参与了依赖ABA的干旱逆境信号转导过程，并且基因间存在功能冗余。

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摘要

英文缩写表

1 前言

2 材料与方法

2．1 供试材料与主要仪器

2．1．1 植物材料

2．1．2 试验仪器

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液配制

2．1．5 主要培养基及营养液配方

2．2 生理试验相关方法

2．2．1 植物材料培养

2．2．2 杂交试验

2．2．3 非生物逆境相关生理表型试验

2．3 分子试验相关方法

2．3．1 SDS方法提取植物基因组DNA

2．3．2 PCR鉴定T-DNA插入突变体

2．3．3 植物总RNA的提取

2．3．4 基因半定量RT-PCR

2．4 试验中所用引物

2．4．1 cpk10×cpk30双突变体DNA水平鉴定用引物

2．4．2 cpk10×cpk30双突变体RNA水平鉴定用引物

2．4．3 非生物逆境相关基因转录水平分析用引物

3 结果与分析

3．1 cpk10×cpk30双突变体的构建及F1代杂合体的获得

3．2 F2代cpk10×cpk30双突变纯合体的筛选

3．3 F3代cpk10×cpk30双突变纯合体的筛选

3．4 cpk10×cpk30双突变纯合体的表型筛选

3．4．1 萌发期表型观察

3．4．2 萌发后生长期表型观察

3．4．3 成苗期表型观察

3．5 干旱相关基因转录水平分析

4 讨论与展望

4．1 CDPKs参与逆境胁迫响应信号转导过程

4．2 CDPK家族间基因存在功能冗余的现象

4．3 CPK10基因在转录水平参与逆境信号转导途径

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

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致谢