EMS诱变花蕾结合小孢子培养获得大白菜突变体的研究

摘要

大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)是原产我国的重要蔬菜，在我国冬季的蔬菜供应中居重要地位。大白菜育种材料单一已成为育种取得突破性进展的瓶颈，创造具有丰富遗传基础的育种材料是大白菜育种工作者研究的重点之一。人工诱变可使自然突变率提高千倍以上，但人工诱变多为隐性突变，将人工诱变与小孢子培养相结合，可以迅速获得基因型纯合的突变体。
　　 本研究以10份不同基因型大白菜‘A01’、‘A06’、‘23P02’、‘85-1’、‘12-2’、‘12-7’、‘A03’、‘A12’、‘A16’和‘A19’为试验材料，采用EMS为诱变剂，分别进行了种子诱变、花蕾诱变结合游离小孢子培养方法的研究，确定了不同处理方法适宜的EMS浓度和处理时间，并对种子诱变后代和花蕾诱变后小孢子植株进行了形态学鉴定及分子辅助鉴定，获得了不同类型的变异材料。主要研究结果如下:
　　 1.以7份不同基因型大白菜种子为材料，研究了不同EMS浓度和时间浸泡种子后种子的发芽率和成苗率。结果表明，在0～0.8％浓度范围内，随着EMS浓度的增大，种子的发芽率和成苗率逐渐降低，初步确定大白菜种子诱变处理的适宜EMS浓度为0.4％～0.6％，处理时间为4～6h。
　　 2.通过对‘A01’、‘A03’、‘A06’和‘23P02’种子诱变M2代植株进行全部形态学鉴定和部分分子学鉴定，共获得49株突变株。从170株‘A01’的M2代中筛选到6株叶片变异株，1株晚抽薹变异株;83株‘A06’的M2代植株中，叶片变异2株;76株‘23P02’的M2代植株中，7株包球方式变异株，1株大花冠变异株;285株‘A03’诱变群体中，1株花蕾变异株，9株子叶变异株，7株苗期叶片变异株，15株花器变异株。
　　 3.以‘85-1’、‘12-2’、‘12-7’、‘A03’和‘A19’为试验材料，进行花蕾诱变后结合小孢子培养，设置诱变浓度和时间梯度，筛选出在叶形、叶色、花冠大小、花色、抽薹性、抗霜霉病上的基因型纯合突变体74株，突变频率15.6％。综合考虑小孢子出胚率、成苗率及有效突变体数，初步确定EMS诱变花蕾并结合小孢子培养这一技术适宜的浓度范围为0.03～0.1％、处理时间5～10min。
　　 4.通过对EMS花蕾诱变后小孢子培养的再生植株倍性调查，发现在获得的再生植株中二倍体植株所占的比例，随EMS浓度增大而降低，单倍体所占比例随EMS浓度增大而升高，初步证明EMS在诱变过程中对染色体的加倍起到抑制作用。
　　 5.通过对大白菜EMS种子诱变和花蕾诱变结合小孢子培养两种诱变方法的比较研究，证明EMS花蕾诱变结合小孢子培养这一新方法可行，比种子诱变和小孢子诱变方法均有优势，并且获得的变异类型比较丰富，为EMS诱变技术在大白菜种质资源创新中的应用开辟了新的途径。
　　 6.通过对EMS花蕾诱变后小孢子培养的再生植株的HRM检测，筛选出花色突变体4株。并且通过与片段直接测序法相比较，证明HRM筛选EMS突变体方法可行，操作简单、成本低、高通量。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 诱变育种研究进展与特点

1．1 诱变育种研究进展

1．2 诱变育种的特点

1．3 EMS诱变育种

2 突变体的选择与鉴定

2．1 形态学和细胞学方法

2．2 诱变与离体培养技术相结合

2．3 生理生化方法

2．4 现代分子生物学方法

2．5 高分辨率熔解技术

3 本研究的目的和意义

第二章 大白菜EMS诱变种子的研究

1 试验材料

2 研究内容与试验方法

2．1 诱变处理及田间种植

2．2 突变体的筛选及鉴定

3 结果与分析

3．1 M1代种子的发芽率和成活率统计

3．2 种子诱变M1表型性状的变异

3．3 种子诱变M2表型性状突变体筛选

3．4 突变体的分子鉴定及筛选

第三章 大白菜EMS诱变结合小孢子培养获得突变体的研究

1 试验材料

2 研究内容与试验方法

2．1 EMS诱变花蕾方法

2．2 小孢子游离与培养

2．3 胚状体分化与植株再生

2．4 试管苗的移栽和再生植株性状调查

2．5 小孢子植株的倍性鉴定

2．6 小孢子突变体植株的筛选和鉴定

3 结果与分析

3．1 EMS处理对小孢子胚胎发生影响的细胞学观察

3．2 EMS处理对不同基因型产胚率的影响

3．3 EMS处理对不同基因型成苗率的影响

3．4 小孢子植株表型倍性鉴定

3．5 再生植株表型性状突变体筛选

3．6 再生植株突变体分子鉴定及筛选

第四章 讨论

1．突变体类型及其应用

2．大白菜EMS种子诱变研究

3．EMS花蕾诱变的适宜浓度和处理时间

4．HRM检测和片段测序方法比较

5．大白菜EMS花蕾诱变结合小孢子培养技术的研究

第五章 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢