高效解磷解钾菌株NX-11的分离筛选鉴定及作用效果分析

摘要

我国耕地土壤中农作物可直接利用的磷钾养分严重匮乏，大量施用化肥的同时也对生态平衡和环境保护造成了影响，制约了农业的发展。微生物肥料不仅能够将土壤中不能被农作物直接利用的固态磷钾转化为可吸收的养分，还具有无毒无污染等优点，可以弥补过量施用化肥产生的负面影响。因此继续寻找和开发高效的微生物肥料具有很大的科学和实践意义。
　　 尽管很多学者对解磷解钾细菌的研究进行了很多，但本研究所筛选的解磷解钾菌株其解磷能力和解钾水平远高于所报道的菌株，同时该菌株对很多病原微生物具有拮抗作用（研究中）。同时本研究还进行了接种试验，研究了其对土壤酶活力的提高和促生长作用，因而本研究所筛选出的菌株具有工业化生产和农业上的应用潜力，有很好的应用前景。
　　 本试验从全国不同地域的不同作物土壤中分离得到的243株芽孢杆菌中，利用平板筛选法获得了34株具有解磷或解钾作用的菌株，经过钼锑抗比色法和四苯硼钠法测定其溶磷解钾量，选取解磷解钾活性较标准菌AC10012 K-1高的菌株，其中获得3株高效解有机磷菌:NX-11、CX-14、BY-4;15株高效解无机磷菌:BY-3、CX-9、SS-14、SS-9、BY-4、CC-14、CX-7、CX-24、SS-8、NX-11、NX-42、 CX-8、 CX-21、SS-12、CC-34;12株高效解钾菌:NX-11、NX-43、CX-9、CX-8、CX-7、BY-4、SS-12、NX-23、CX-14、BY-3、NX-12、NX-42。从以上34株菌中筛选出解磷解钾能力最高的菌株NX-11，并通过生理生化反应及16S rDNA基因序列分析对NX-11菌株进行了鉴定。生理生化反应显示菌株NX-11特征与枯草芽孢杆菌枯草亚种相似。将16S rDNA序列在NCBI网站中进行同源性比较，利用Neigllbor-Joining法绘制系统发育树，结果显示NX-11菌株与Bacillus subtilis subsp.Subtilis的16S rDNA序列同源性达到99.71％，结合生理生化反应及16S rDNA基因序列分析鉴定NX-11菌株为Bacillussubtilis subsp.Subtilis。
　　 在液体摇瓶条件下高效解磷解钾菌株NX-11，解磷解钾活性分别为有机磷8.06mg/L、无机磷62.35 mg/L、钾长石9.61 mg/L，该菌株对有机磷的分解效果达到参比菌株K-1的1.38倍;对无机磷的分解效果达到参比菌株K-1的1.35倍;对难溶性钾的分解效果达到参比菌株K-1的6.41倍。
　　 本文对NX-11菌株产芽孢条件进行研究，为其进入工业化生产及应用提供了理论依据。通过正交试验得到其培养基最佳配比为:葡萄糖0.2％，豆饼粉0.5％，NaCl0.05％，MgSO40.07％，K2HPO40.05％，酵母膏0.05％;最佳培养条件为:种龄20h、接种量10％、培养基初始pH值6.0、装量100 mL/250 mL。通过优化使芽孢生成率大幅提高，优化后芽孢生成率达到97.78％，同时缩短了发酵时间，为其工业化生产提供了依据。
　　 通过玉米盆栽试验验证了NX-11菌株的应用效果，结果表明:叶面积增加5.6％，株高增高8.0％，干湿重增加率分别为21.6％和68.3％，土壤中速效钾和有效磷的含量高于对照。通过测定玉米盆栽试验中不同生育期土壤酶活力和磷钾养分含量，研究了NX-11菌株对酶活力和土壤养分的影响。其中土壤速效磷含量测定采用钼锑抗比色法，速效钾含量测定采用火焰光度计法;蔗糖酶活性测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法;过氧化氢酶活性采用0.1 mol/L高锰酸钾滴定法测定;脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定;磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法。生长到五叶期土壤各种酶活性均高于对照，其中蔗糖酶活性增加了0.33 mg/g;过氧化氢酶活性增加了0.40 mg/g;磷酸酶活性增加了1.22 mg/g;脲酶活性增加了0.14 mg/g;且随着土壤酶活力的提高，土壤速效磷和速效钾含量也发生了变化，速效钾含量提高29.5％，速效磷含量提高122.2％。研究结果表明玉米接种NX-11菌株后，生长到五叶期土壤各种酶活性均高于对照，NX-11菌株有较好的解磷解钾应用效果，具有很好的开发前景。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 土壤中的磷钾概况

1．1．1 土壤中磷概况

1．1．2 土壤中钾概况

1．2 微生物肥料

1．2．1 微生物肥料简介

1．2．2 微生物肥料的作用机理

1．2．3 解磷解钾微生物肥料的巨大效益

1．2．4 微生物肥料的发展趋势

1．2．5 微生物肥料的应用前景

1．3 土壤磷钾含量和土壤酶活力的关系

1．4 存在问题及展望

第二章 土壤中高效解磷解钾菌株的分离、筛选

2．1 试验材料

2．1．1 土壤样品

2．1．2 培养基

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要试剂

2．2 试验方法

2．2．1 土样采集

2．2．2 土壤样品中芽孢杆菌菌株的分离

2．2．3 解磷解钾芽孢杆菌的分离与培养

2．2．4 菌落计数

2．3 结果与分析

2．3．1 土壤样品中芽孢杆菌的分离结果

2．3．2 具有解磷解钾效果的芽孢杆菌的筛选结果

2．4 讨论

第三章 高效解磷解钾菌的筛选

3．1 试验材料

3．1．1 供试菌株

3．1．2 参比菌株

3．1．3 培养基

3．1．4 试验试剂

3．1．5 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 菌株解磷解钾能力测定方法

3．2．2 菌液制备

3．2．3 发酵液的预处理

3．2．4 解磷效果测定试验

3．2．5 解钾效果测定试验

3．3 结果与分析

3．4 讨论

第四章 高效解磷解钾菌株NX-11的鉴定

4．1 试验材料

4．1．1 供试菌种

4．1．2 培养基

4．1．3 主要仪器

4．1．4 主要试剂

4．2 试验方法

4．2．1 菌落形态观察

4．2．2 菌体形态观察

4．2．3 细菌的简单染色方法

4．2．4 生理生化特征鉴定

4．2．5 NX-11菌株总DNA的提取

4．2．6 琼脂糖电泳的检测

4．2．7 NX-11菌株16S rDNA的PCR扩增

4．2．8 NX-11菌株16S rDNA序列分析及系统发育树绘制

4．3 结果与分析

4．3．1 NX-11菌株的菌落和菌体形态

4．3．2 生理生化特征鉴定结果

4．3．3 高效解磷解钾菌株NX-11的16SrDNA序列测定及分析

4．4 讨论

第五章 NX-11菌株产芽孢条件的优化

5．1 试验材料

5．1．1 菌株

5．1．2 培养基及试剂

5．1．3 主要仪器和设备

5．2 试验方法

5．2．1 培养方法

5．2．2 芽孢形成率和生物量的测定方法

5．2．3 正交试验

5．3 结果与分析

5．3．1 不同碳源对芽孢形成的影响

5．3．2 不同氮源对芽孢形成的影响

5．3．3 不同无机盐对芽孢形成的影响

5．3．4 培养基浓度正交试验

5．3．5 培养条件正交试验

5．4 讨论

第六章 NX-11菌株接种玉米对玉米生理性状、土壤磷钾养分和土壤酶活性的影响

6．1 材料和方法

6．1．1 供试菌株

6．1．2 供试玉米

6．1．3 供试土壤

6．1．4 培养基

6．1．5 试验试剂

6．1．6 试验仪器

6．2 试验方法

6．2．1 玉米盆栽试验方法

6．2．2 土壤样品的预处理

6．2．3 玉米生理性状的测定方法

6．2．3 土壤理化指标及酶活力的测定

6．2．4 土壤中理化性质的测定

6．3 结果与分析

6．3．1 盆栽试验结果

6．3．2 土壤速效养分测定

6．3．3 土壤酶活测定结果

6．4 讨论

第七章 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢