玉米秸秆腐解复合菌系YM-1的构建及其降解性能研究

摘要

本文针对北方玉米秸秆还田地区秸秆降解速度缓慢，从而影响下茬作物生长的状况，以山东德州、泰安等地玉米秸秆连续多年还田的土壤样品为菌源，筛选具有降解纤维素能力的菌株，通过菌株间拮抗试验构建复合菌系YM-1，通过液体、固体发酵试验中菌系的CMC酶活、滤纸酶活、木聚糖酶活和PCR-DGGE监测菌群的动态变化，评价YM-1的功能及其组成稳定性;最后通过模拟田间试验评价复合菌系YM-1的应用效果。论文的主要结果如下:
　　 1)采用CMC-刚果红染色法从土壤中分离筛选了15株产纤维素酶菌株，在对其进行低温诱导试验中发现菌株M11在13℃低温环境下仍能高效分解纤维素，鉴定M11为草酸青霉（Penicillium oxalicum）。发酵试验表明:以玉米秸秆粉为唯一碳氮源，13℃、200 r/min摇床发酵培养9d时，纤维素酶活力最高为33.08 U/mL。对其酶学性质初步研究表明该酶最适pH为5.0，最适反应温度为20℃，在5℃～20℃间酶活力仍能保持在90％以上。
　　 2)根据液体发酵中各菌株纤维素酶活力大小，从上述15株菌中筛选出4株产酶能力较高的菌株X11、M11、M14、F7，将它们与对照菌株里氏木霉DSM768（南京农业大学资源与环境学院赠送）及实验室保存的具有降解玉米秸秆的复合菌系CSS-1组配得到新的复合菌系YM-1。
　　 3)采用液体发酵试验研究复合菌系YM-1的产酶能力、结果表明:复合系YM-1在28℃、200 r/min条件下液体发酵培养7d时CMC酶活力达到最大值29.87 U/mL，滤纸酶活力为17.14 U/mL，第9d时木聚糖酶活力最大为23.6 U/mL，发酵液的pH值随时间的延长呈先下降后升高的趋势。
　　 4)菌系YM-1的功能稳定性:针对F10、F15、F20代固态发酵产物测得的纤维素酶活力及木聚糖酶活力，结果表明在复合菌系YM-1腐解过程中，不同代的复合系酶活变化幅度较小，各代酶活曲线的变化基本相同，都呈现出由低到高再降低的趋势，说明复合菌系的产酶能力非常稳定。
　　 5)菌系YM-1的组成稳定性及多样性分析:采用PCR-DGGE分析YM-1的F2、F5、F10、F15、F20、F25代菌种组成，结果表明不同继代复合菌系中细菌与真菌的组成稳定;DGGE条带回收分析后发现:F15代不同发酵时间内DGGE条带亮度与呈现的位置是不同的，菌系中的微生物组成具有多样性。
　　 6)在模拟田间试验中，采用失重率法测定不同处理下玉米秸秆的失重率，结果表明:对照、复合菌系YM-1、CSS-1及菌剂A处理的秸秆干重都有所降低，对照秸秆失重率为13.1％，菌剂A为19.5％，CSS-1为30.6％，而YM-1的失重率最高达到36.9％，说明复合菌系YM-1对玉米秸秆具有较强的降解能力。
　　 7)在模拟田间试验中，采用BIOLOG生态板测定不同处理的AWCD（微平板孔内平均颜色变化率）来分析腐解微生物的代谢活性，YM-1处理的AWCD曲线在12h～96h范围内斜率最大，后期168 h的AWCD值最高达3.69;菌剂A、CSS-1和对照的AWCD最大值分别为3.03、2.80和2.78。说明YM-1处理中微生物的代谢活性最高。

目录

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摘要

第一章 绪论

1．1 秸秆资源及利用概况

1．1．1 秸秆资源及组成

1．1．2 秸秆的利用现状

1．1．3 秸秆资源化利用过程中存在的问题

1．2 秸秆还田技术研究进展

1．2．1 国内外秸秆还田技术研究进展

1．2．2 秸秆还田效应研究

1．3 秸秆降解的酶学及微生物学研究

1．3．1 降解作物秸秆的酶类

1．3．2 降解秸秆的微生物

1．4 秸秆腐解复合菌系研究进展

1．4．1 秸秆复合菌系的研究概况

1．4．2 秸秆复合菌系研究存在的问题与解决措施

1．5 分子生态学技术在复合菌系筛选中的应用

1．5．1 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术

1．5．2 Biolog技术简介

1．6 本论文研究目的与意义

第二章 纤维素降解菌株的筛选与鉴定

2．1 试验材料

2．1．1 土样

2．1．2 对照菌株

2．1．3 玉米秸秆粉

2．1．4 培养基

2．1．5 所需试剂及配制方法

2．1．6 试验设备

2．2 试验方法

2．2．1 菌株初筛

2．2．2 复筛

2．2．3 菌种鉴定

2．3 试验结果与分析

2．3．1 菌株筛选

2．3．2 菌株复筛

2．3．3 菌株鉴定

2．4 讨论

第三章 低温产纤维素酶菌株的筛选及酶学性质研究

3．1 试验材料

3．1．1 供试菌株与对照菌株

3．1．2 所需试剂

3．1．3 培养基

3．2 试验方法

3．2．1 温度梯度诱导

3．2．2 酶活力测定

3．2．3 M11菌株生长特性

3．2．4 M11菌株酶学性质初步研究

3．3 结果和分析

3．3．1 低温产纤维素酶菌株的筛选

3．3．2 菌株形态学

3．3．3 M11菌株生物学鉴定结果

3．3．4 菌株M11生长曲线

3．3．5 菌株M11纤维素酶学性质

3．4 讨论

第四章 玉米秸秆腐解复合菌系YM-1的构建与降解特性研究

4．1 试验材料

4．1．1 试验菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 所需试剂及配制方法

4．1．4 主要仪器及设备

4．2 试验方法

4．2．1 复合菌系YM-1的构建

4．2．2 复合菌系YM-1的降解特性

4．2．3 复合菌系YM-1功能与组成稳定性研究

4．3 试验结果与分析

4．3．1 复合菌系YM-1的构建

4．3．2 YM-1的降解特性

4．3．3 菌系YM-1降解功能稳定性

4．3．4 菌系YM-1组成稳定性及微生物动态分析

4．4 讨论

第五章 实验室模拟田间降解效果研究

5．1 试验材料

5．1．1 供试菌系

5．1．2 种子培养基

5．1．3 其他材料

5．2 试验方法

5．2．1 种子液制备

5．2．2 模拟田间试验

5．2．3 秸秆失重率的测定

5．2．4 微生物菌群分析

5．3 试验结果与分析

5．3．1 秸秆失重率测定

5．3．2 不同处理条件下秸秆腐解微生物的AWCD分析

5．4 讨论

第六章 结论

6．1 本论文的主要结论

6．2 存在的问题与建议

参考文献

在读期间已发表论文

作者简历

致谢