CTSB、CTSS基因表达与绵羊卵丘细胞凋亡及卵母细胞发育能力相关性研究

摘要

本研究通过qRT-PCR技术检测成年绵羊和羔羊卵丘细胞内组织蛋白酶(CTSB、CTSS)基因表达规律，Tunel染色并结合流式细胞仪检测卵丘细胞凋亡，研究成熟培养液中添加不同浓度组织蛋白酶特异性抑制剂E-64对卵丘细胞凋亡及卵母细胞发育能力的影响。探究CTSB、CTSS基因表达、绵羊卵丘细胞凋亡与卵母细胞发育能力相关性，以期探索提高绵羊卵母细胞成熟及发育潜能的新途径。研究结果如下:
　　成年绵羊与羔羊卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的E-64(0μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)，分别于体外成熟(IVM)的0h、8h、16h、24h检测组织蛋白酶基因表达量，结果表明:成年绵羊及羔羊卵丘细胞内CTSB、CTSS基因表达量在体外成熟过程中，随时间的延长而逐渐下降;E-64添加组卵丘细胞内CTSB、CTSS基因表达量均在不同程度上低于对照组，其中5μmol/L和10μmol/L组于IVM8h、16h、24h基因表达量与对照组相比，被显著下调(p＜0.05)，5μmol/L和10μmol/L组间差异不显著（P＞0.05）。
　　卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度E-64(0μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)，于体外成熟的不同时间点(成年羊于IVM的0h、8h、16h、24h;羔羊于IVM的0h、24h)检测卵丘细胞凋亡，结果表明:成年绵羊与羔羊卵丘细胞累积凋亡率与体外成熟时间呈正相关;成年绵羊体外成熟过程中新生凋亡率呈现先逐渐升高， IVM16h达到高峰，再逐渐降低的规律;成熟液中添加E-64可以下调卵丘细胞的凋亡水平，具有剂量依赖性的特点，添加5μmol/L、10μmol/L E-64对卵丘细胞凋亡的抑制效果显著高于0μmol/L和1μmol/L组(p＜0.05)，但5μmol/L和10μmol/L E-64组间无显著差异（P＞0.05）。
　　将羔羊与成年绵羊卵丘细胞内CTSB、CTSS基因表达量及凋亡进行对比，结果表明，羔羊卵丘细胞内CTSB、CTSS的mRNA表达量均极显著高于成年绵羊(p＜0.01);IVM0h羔羊卵丘细胞累积凋亡率极显著高于成年绵羊(P＜0.01);24h时，对照组羔羊卵丘细胞累积凋亡率显著高于成年羊(P＜0.05)，5μmol/L、10μmol/L E-64添加组则极显著高于成年羊（P＜0.01）。
　　成熟液中添加不同浓度E-64(0μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)，分别培养成年绵羊卵母细胞，成熟后的卵母细胞经体外受精和胚胎发育后，检测各项指标，结果表明:各组卵母细胞成熟率、卵裂率均无显著差异(P＞0.05);5μmol/L和10μmol/LE-64组囊胚率极显著高于对照组(0μmol/L)(P＜0.01)，但5μmol/L与10μmol/L间无显著差异（P＞0.05）。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 卵丘细胞与卵母细胞间的结构与功能

1．1．1 卵丘细胞与卵母细胞间的结构联系

1．1．2 卵丘细胞与卵母细胞间的功能联系

1．1．3 卵丘细胞凋亡对卵母细胞发育能力的影响

1．2 溶酶体组织蛋白酶概述

1．2．1 组织蛋白酶简介

1．2．2 组织蛋白酶的分类

1．2．3 组织蛋白酶的功能

1．3 组织蛋白酶与细胞凋亡

1．3．1 组织蛋白酶参与细胞凋亡的机制

1．3．2 组织蛋白酶、卵丘细胞凋亡及胚胎发育间的相关性

1．4 细胞凋亡研究历程概述

1．4．1 细胞凋亡的概念

1．4．2 细胞凋亡特征及机制

1．4．3 细胞凋亡意义

1．4．4 细胞凋亡检测方法

1．5 本研究拟解决的关键技术问题及意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 主要仪器设备

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要溶液配制

2．2 绵羊卵母细胞采集及体外胚胎生产

2．2．1 绵羊COCs的采集

2．2．2 卵母细胞的体外成熟

2．2．3 卵母细胞体外受精及胚胎发育培养

2．2．4 囊胚细胞荧光染色

2．3 绵羊卵丘细胞内CTSB、CTSS基因表达检测方法

2．3．1 总RNA的提取和检测

2．3．2 反转录合成cDNA

2．3．3 PCR反应

2．3．4 qRT-PCR标准品的制备

2．4 绵羊卵丘细胞凋亡检测方法

2．4．1 样品准备

2．4．2 标记说明

2．5 试验设计

2．5．1 绵羊CTSB、CTSS基因表达规律研究

2．5．2 绵羊卵丘细胞凋亡率检测

2．5．3 E-64对绵羊卵母细胞成熟的影响

2．5．4 E-64对绵羊卵母细胞体外受精效率的影响

2．5．5 E-64对绵羊体外受精后胚胎质量的影响

2．6 数据分析

3 结果

3．1 绵羊卵丘细胞内CTSB、CTSS基因表达规律分析

3．1．1 CTSB、CTSS基因qRT-PCR结果

3．1．2 成年绵羊卵丘细胞CTSB、CTSS基因表达规律

3．1．2 羔羊卵丘细胞中CTSB、CTSS基因表达规律

3．1．3 成年羊与羔羊卵丘细胞中CTSB、CTSS基因表达差异

3．2 添加不同浓度E-64对绵羊卵丘细胞凋亡的影响

3．2．1 卵丘细胞凋亡结果分析

3．2．2 成年绵羊卵丘细胞凋亡结果

3．2．3 羔绵羊卵丘细胞凋亡结果

3．2．4 成年羊及羔羊卵丘细胞凋亡差异比较

3．3 添加不同浓度E-64对成年羊卵母细胞成熟及胚胎发育影响结果

3．3．1 添加不同浓度E-64对成年羊卵母细胞体外成熟效果的影响

3．3．2 添加不同浓度E-64对成年羊卵母细胞体外发育能力的影响

3．3．3 添加不同浓度E-64对囊细胞数的影响

4 讨论

4．1 绵羊卵丘细胞内CTSB、CTSS基因表达规律分析

4．1．1 绵羊卵丘细胞内CTSB、CTSS基因随时间变化的表达规律

4．1．2 E-64浓度与绵羊卵丘细胞内CTSB、CTSS基因表达的相关性

4．2 绵羊卵丘细胞凋亡规律分析

4．2．1 绵羊卵丘细胞凋亡随时间的变化

4．2．2 添加不同浓度E-64对绵羊卵丘细胞凋亡规律的影响

4．3 成年绵羊与羔绵羊卵丘细胞凋亡规律分析

4．4 E-64对绵羊卵母细胞发育能力影响的分析

4．5 组织蛋白酶、细胞凋亡及卵母细胞发育命运的相关性分析

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢