黄淮海大豆高异黄酮种质筛选与相关基因差异表达分析

摘要

大豆(Glycine max L.)是我国广泛种植的经济作物，具有丰富的蛋白质和脂肪，其子粒中含有的生理活性物质——异黄酮更是被广泛应用于保健行业和医学领域。异黄酮属于生物黄酮的一种，只能在植物体内合成。本研究利用高效液相色谱技术(HPLC)分析黄淮海生态区大豆品种资源子粒异黄酮含量，遴选高、低异黄酮含量特异种质;在此基础上，采用实时定量PCR技术分析异黄酮代谢途径相关基因在高、低异黄酮含量品种中的差异表达，寻找关键基因;并利用RNAi技术将低异黄酮含量大豆品种的异黄酮合成重要分支基因进行沉默。主要研究结果如下:
　　1.利用精密度、重现性、稳定性和回收率试验，确定了HPLC方法及条件。精密度试验的相对标准偏差(RSD)分别为0.96％、1.53％和1.31％;重现性试验的RSD分别为1.89％、1.85％和1.65％;日内稳定性RSD为1.76％、0.89％和1.27％，日间稳定性RSD分别为0.98％、1.28％和1.02％;大豆苷、黄豆黄苷和染料木苷的加标回收率分别为98.91％、99.93％和101.46％，相对应的RSD值为1.42％、1.89％和1.73％。可见，该方法可靠性高、稳定性强，可用于大豆异黄酮测定。
　　2.利用HPLC技术测定了黄淮海生态区213份大豆品种资源异黄酮含量。野生大豆异黄酮含量分布在3896～7440μg/g，平均含量超过5000μg/g，最大差异达3544.3μg/g（约1.9倍）;栽培大豆异黄酮含量分布在1463～6116μg/g，平均含量超过3500μg/g，最大差异可达4652.9μg/g（约4.2倍）。在此基础上，遴选出异黄酮含量超过6000μg/g特异种质4份，其中超过7000μg/g种质1份。
　　3.利用实时定量PCR技术分析了异黄酮合成途径相关基因在不同大豆品种、发育时期、组织部位中的表达差异。其中PAL、C4H、4CL基因在高异黄酮含量大豆品种R2时期的表达量显著高于低异黄酮品种;CHS、IFS在高异黄酮大豆品种R8时期的表达量显著高于低异黄酮品种;CPR在低异黄酮大豆叶片与子粒R7时期的表达量显著高于高异黄酮品种;F3H主要在R5期与异黄酮合成基因竞争底物。可见，高、低异黄酮含量大豆品种中的相关基因表达量存在显著差异，与异黄酮含量的高低密切相关。
　　4.构建了异黄酮合成途径相关基因F3H的RNAi载体pCAMB IA3301-ASF3H，并利用花粉管通道转化技术将表达载体转入不同大豆品种，经PCR与除草剂抗性检测获得了转基因植株。

目录

声明

摘要

本文所用缩略词及中文对照

1 引言

1．1 大豆异黄酮及其重要医用价值

1．2 大豆种质资源异黄酮含量研究现状

1．3 大豆异黄酮合成代谢途径及其相关基因

1．4 本研究目的意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试品种

2．1．2 试剂材料

2．1．3 主要仪器

2．2 试验方法

2．2．1 供试大豆品种资源异黄酮含量测定所用方法

2．2．2 异黄酮代谢途径相关基因差异表达分析所用方法

2．2．3 异黄酮代谢途径关键基因转化大豆所用方法

3 结果与分析

3．1 黄淮海大豆异黄酮含量分析与特异种质遴选

3．1．1 异黄酮含量测定回归方程的建立

3．1．2 异黄酮含量测定方法的可靠性检验

3．1．3 供试大豆种质资源异黄酮及其组分含量综合评价

3．2 大豆异黄酮代谢途径相关基因的差异表达分析

3．2．1 供试大豆品种总RNA提取与cDNA合成

3．2．2 异黄酮代谢途径相关基因实时定量PCR引物扩增产物的检测

3．2．3 异黄酮代谢途径相关基因的差异表达分析

3．3 大豆异黄酮合成途径关键时期及重要基因的遴选

3．4 黄烷酮3-羟化酶基因F3H转化大豆研究

3．4．1 F3H基因RNAi载体的构建

3．4．2 RNAi载体pCAMBIA3301-ASF3H转化大豆研究

4 讨论

4．1 大豆品种资源异黄酮含量测定及特异种质遴选的意义

4．2 大豆异黄酮代谢途径相关基因的表达差异及其机理

4．3 转F3H反义载体大豆阳性材料的应用

4．4 本研究的下一步工作设想

5 结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢