降解黄曲霉毒素M1细菌菌株的研究

摘要

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是一种由寄生曲霉、黄曲霉、赭曲霉等真菌产生的次级代谢产物，具有高致癌、高致畸和高致突变性，1993年被世界卫生组织划定为Ⅰ类致癌物质。其中黄曲霉毒素M1(Aflatoxin，AFM1)主要存在于动物的肉、蛋、奶中。目前控制黄曲霉毒素M1的方法只是通过控制它的前体物质黄曲霉毒素B1在饲料中的含量，减少转化来防止黄曲霉毒素M1对奶制品的污染，而当奶制品中已经出现了黄曲霉毒素M1时却没有有效的办法来去除。近年来生物降解的方法越来越受到人们的关注，它具有高效，副作用少，对食品营养损失小甚至可以增加食品营养成分等优点。本试验则秉承这一理念筛选出一株能够降解黄曲霉毒素M1的细菌菌株，并优化了菌株的发酵条件，研究了菌株降解黄曲霉毒素的机理，对起降解作用的活性物质进行了初步分离提取，主要研究结果如下:
　　(1)降解黄曲霉毒素AFM1菌株的筛选:实验共采集38种动物粪便样本，1个污水处理厂活性污泥样本;3种花生地土壤样本，以香豆素为唯一的碳源和能源进行目的菌株的初步筛选，共筛选出50株菌。然后以菌株对黄曲霉毒素M1的降解率作为筛选指标，筛选出10株降解率在60％以上的菌株，最终选取降解率最高，编号为E-1-1-1菌株为目标菌株，其降解效果可达89.55％;试验还研究了菌株生长曲线，发现0～4h为菌株延滞期，4～16h为菌株对数期。
　　(2)菌株E-1-1-1细菌分类学鉴定:通过分区划线和革兰氏染色观察，菌株菌落小而圆，凸起，边缘光滑整齐，乳白色，湿润，菌体革兰氏染色呈阳性，杆状，两端钝圆;Biolog鉴定结果显示，E-1-1-1与短小芽孢杆菌生理生化试验相似度大于0.6，与其他菌株相似度小于0.05，鉴定结果为芽孢杆菌;16SrDNA分子鉴定E-1-1-1与芽孢杆菌相似率为99％。结合该菌株的菌体菌落形态、Biolog生理生化反应特征和16SrDNA分子测序并构建系统发育树结果，在细菌分类学上E-1-1-1被初步鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。
　　(3)芽孢杆菌E-1-1-1降解AFM1条件优化:经单因素试验，E-1-1-1菌株降解AFM1的最佳碳源为麦芽糖，最佳氮源为酵母粉，最佳起始pH值为6，最佳温度为37℃，最佳接种量为3％。对pH，温度和接种量进行正交试验设计，确定了最佳培养条件:温度为42℃，起始pH值为5.5，接种量为3％时降解率最高，达到了92.5％，比优化前提高了2.95％。
　　(4)芽孢杆菌E-1-1-1降解AFM1机理研究:实验测定了菌株对AFM1的降解效率，在12h内降解率达到最大;试验初步探究了E-1-1-1菌株去除黄曲霉毒素M1的机理，去除方式为降解而非吸附;降解作用活性物质主要来自细菌细胞外的代谢产物，降解率为76.9％;发酵上清液用硫酸铵沉淀法进行沉淀分离后，75％硫酸铵沉淀得到的蛋白降解率最高，能够达到54.33％，蛋白反应的最适温度为42℃时降解率最高，可达到67.5％，据SPSS软件进行差异性分析得P＜0.05，各温度梯度间差异性显著，说明温度对活性蛋白的影响显著，蛋白对pH的要求不是很严格，适宜范围从5～7都可以，范围比较宽，这是这种活性蛋白的一大特点;将75％硫酸铵沉淀得到的蛋白用超滤法继续分离，得到蛋白分子量在1KD以下范围内的蛋白降解率为22.6％，1KD～3KD之间的蛋白降解率为12.7％，3KD～5KD之间的蛋白降解率为21.2％，5KD～10KD之间的蛋白降解率为7.1％，10KD以上的蛋白降解率为30.7％，各组分降解率总和为94.3％，与先前测量的菌液的降解率92.5％接近，分析原因可能是因为降解AFM1的活性蛋白可能是一种复合蛋白。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 研究背景

1．1．1 黄蓝霉毒素理化性质

1．1．2 黄曲霉毒素生物合成途径

1．1．3 影响黄曲霉毒素产生的因素

1．1．4 黄曲霉毒素危害

1．1．5 黄曲霉毒素M1检测方法

1．1．6 黄曲霉毒素去毒方法

1．2 本研究的目的及意义

1．3 本研究的主要内容

1．3．1 降解黄曲霉毒素M1菌株的筛选

1．3．2 降解黄曲霉毒素M1菌株的鉴定

1．3．3 对菌株降解黄曲霉毒素M1条件进行优化

1．3．4 对菌株降解黄曲霉毒素的机理进行研究

第二章 降解黄曲霉毒素M1菌株的筛选

2．1 试验材料

2．1．1 试验样品

2．1．2 培养基

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要化学试剂

2．2 试验方法

2．2．1 样本采集

2．2．2 菌株筛选流程

2．2．3 菌株初筛

2．2．4 菌株复筛

2．2．5 AFMI提取与测定

2．2．6 AFMI标准曲线绘制

2．2．7 菌株生长曲线测定

2．3 试验结果

2．3．1 标准曲线绘制结果

2．3．2 初筛结果

2．3．3 复筛结果

2．3．4 生长曲线测定

2．4 讨论

2．5 结论

第三章 降解黄曲霉毒素M1菌株的鉴定

3．1 试验材料

3．1．1 试验菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 主要化学试剂

3．2 试验方法

3．2．1 菌落形态观察

3．2．2 菌体形态观察

3．2．3 Biolog细菌鉴定

3．2．4 16SrDNA分子鉴定及系统发育树构建

3．3 试验结果

3．3．1 菌落及菌体形态

3．3．2 Biolog生理生化鉴定结果

3．3．3 16SrDNA分子鉴定及发育树构建结果

3．4 讨论

3．5 结论

第四章 芽孢杆菌E-1-1-1降解黄曲霉毒素M1条件优化

4．1 试验材料和方法

4．1．1 试验菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 试验仪器

4．1．4 试验试剂

4．1．5 菌株培养

4．2 结果与分析

4．2．1 营养条件单因素

4．2．2 培养条件单因素

4．2．3 正交试验结果

4．3 结论

第五章 芽孢杆菌E-1-1-1降解黄曲霉毒素M1机理研究

5．1 试验材料

5．1．1 试验菌株

5．1．2 培养基

5．1．3 试验仪器

5．1．4 试验试剂

5．2 试验方法

5．2．1 菌株降解曲线测定

5．2．2 细菌去除AFM1机理为降解或吸附的区分

5．2．3 活性物质属胞内胞外物质的确定

5．2．4 硫酸铵分级沉淀法提取纯化活性物质

5．2．5 超滤法分离提取活性物质

5．2．6 AFM1提取与测定

5．3 试验结果

5．3．1 菌株E-1-1-1降解AFM1曲线

5．3．2 菌株去毒方式确定

5．3．3 菌株E-1-1-1降解AFM1活性物质位置确定

5．3．4 硫酸铵分级沉淀法提取纯化活性物质

5．3．5 超滤所得组分降解率测定

5．4 讨论

5．5 结论

第六章 结论

6．1 本试验主要结论

6．2 本研究创新点

6．3 展望

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢