小麦全蚀病拮抗芽孢杆菌的分离筛选及盆栽生防试验

摘要

小麦全蚀病是由禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var.tritic，简称G.g.t)引起的根部病害，分布相当广泛，在全国各地麦区都有发生，严重影响我国小麦的生产。目前尚缺乏有效的小麦全蚀病抗病品种，主要靠轮作倒茬和化学药剂来防治。但因小麦全蚀病菌在土壤中存活时间较长，而小麦是我国主要的粮食作物，长时期轮作不现实。化学农药只能除掉种子中携带的病原菌，不能根除土壤中的病原菌，并且还存在易残留、污染环境、病原菌容易产生抗药性等问题。而生物防治能使拮抗菌在土壤中大量富集，可以长期对土壤中的病原菌产生拮抗作用。因此生物防治已成为小麦全蚀病防治研究的热点。本研究从发病土壤中分离、筛选得到对小麦全蚀病菌(G.g.t)拮抗活性较强的生防芽孢杆菌菌株，并从菌丝形态方面观察了生防菌株对小麦全蚀病菌的影响，初步研究了菌株的防治效果及对小麦的促生长作用，为开发有效的生防菌剂奠定基础。
　　从河北省部分地区采集小麦全蚀病发病土壤，分离到306株芽孢杆菌，利用平板对峙培养法筛选到4株对小麦全蚀病菌（G.g.t）拮抗作用较强的芽孢杆菌，其中Z-9菌株拮抗作用最强，抑菌带宽达2.90cm。挑取抑菌带边缘的菌丝进行显微镜观察，发现Z-9菌株能使小麦全蚀病菌(G.g.t)菌丝膨大、断裂。通过菌落、菌体及芽孢形态观察，生理生化特性试验和16S rDNA序列分析，鉴定Z-9菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。
　　利用单因素试验和正交试验对Z-9菌株进行了摇瓶发酵条件优化，确定最适培养基及最适发酵条件为玉米粉1.00％、黄豆饼粉2.00％、MnSO4·H2O0.04％、MgSO4·7H2O0.04％，初始pH7.5，250mL三角瓶装液量为50mL，37℃培养36h。优化后菌浓(1.60×109CFU·mL-1)提高到优化前(1.50×108CFU·mL-1)的9.60倍。为今后生防菌剂的工业生产试验提供了依据。
　　施用后对作物的生长发育没有负面影响是作为生防菌剂的必要条件。因此，本研究首先进行了Z-9菌剂小麦萌发和促生长试验。将表面消毒的20粒小麦种子放在用2.00mL Z-9菌悬液浸湿的位于灭菌平皿（φ9.00cm）中的滤纸（φ8.50cm）上面，放入28℃培养箱中对小麦种子进行催芽促生长试验，用2.00mL无菌水浸泡滤纸作为空白对照。经3d生长后检测根长和芽长，结果表明，当浓度为1.00×109～1.00×1010 CFU·mL-1时，平均芽长和根长增长最大，分别比对照组增加了55.30％和46.90％，表明该菌剂能促进小麦种子萌发后根和芽的生长，但对小麦种子的发芽率没有影响。
　　在明确了该菌剂对小麦有促生长作用的基础上，进行了盆栽防治试验，考察该菌剂对小麦全蚀病的防治效果。在病原菌饼上接种经过不同处理方式（拌种、浸种、浇种）的小麦种子，一个月后检测小麦全蚀病发病情况并对小麦的根长、根重、株高、株重进行测量。结果表明，拌种、浸种、浇种都有一定的防效，其中浇种的防效最高，在1.00×109～1.00×1010 CFU·mL-1浓度时平均防效达58.04％，并且平均根长、株高、根重、株重也增加最多，分别比对照组增加了532.23％、80.65％、44.44％、363.15％。该试验为菌剂的最佳施用方式提供了依据。

目录

声明

摘要

引言

第1章 文献综述

1．1 小麦全蚀病的危害及研究现状

1．1．1 小麦全蚀病的发现、危害及症状

1．1．2 小麦全蚀病的病原菌研究概况

1．2 小麦全蚀病的侵染、传播

1．2．1 小麦全蚀病菌的侵染

1．2．2 小麦全蚀病菌的传播

1．3 小麦全蚀病的防治研究进展

1．3．1 农业防治

1．3．2 抗病品种利用

1．3．3 化学药剂防治

1．3．4 生物防治

第2章 小麦全蚀病生防芽孢杆菌Z-9的分离筛选及鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 供试土壤及菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 试验仪器

2．1．4 芽孢杆菌的分离纯化

2．1．5 病原菌菌带和菌饼的制备

2．1．6 小麦全蚀病拮抗芽孢杆菌的筛选

2．1．7 拮抗性芽孢杆菌对小麦全蚀病病原菌菌丝的影响

2．1．8 菌株的形态学鉴定

2．1．9 菌株的生理生化鉴定

2．1．10 分子生物学鉴定

2．2 试验结果

2．2．1 拮抗菌株的筛选

2．2．2 小麦全蚀病拮抗菌对小麦全蚀病病原菌菌丝的影响

2．2．3 形态学及生理生化鉴定

2．2．4 构建菌株系统发育树

2．3 小结

2．4 讨论

第3章 小麦全蚀病拮抗菌Bacillus methylotrophicus Z-9菌株摇瓶发酵条件优化

3．1 材料及方法

3．1．1 供试菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 仪器

3．1．4 种子液培养

3．1．5 生物量和芽孢产率的检测

3．1．6 单因素试验

3．1．7 培养基浓度正交试验

3．1．8 培养条件正交试验

3．2 试验结果

3．2．1 碳源对Z-9菌株发酵液菌浓及芽孢产率的影响

3．2．2 氮源对Z-9菌株发酵液菌浓及芽孢产率的影响

3．2．3 无机盐对Z-9菌株摇瓶发酵液菌浓及芽孢产率的影响

3．2．4 培养基组分浓度正交试验结果

3．2．5 培养条件正交试验结果

3．3 小结

3．4 讨论

第4章 Z-9菌株对小麦种子的促生长作用及盆栽防治效果

4．1 材料与方法

4．1．1 供试菌株

4．1．2 供试小麦种子

4．1．3 培养基

4．1．4 试验仪器

4．1．5 Z-9菌株的培养和菌悬液的制备

4．1．6 小麦消毒及Z-9菌株的施用方法

4．1．7 Z-9菌悬液对小麦种子萌发及促生长作用

4．1．8 盆栽防治效果测定

4．1．9 病害调查统计方法和植株生长状况检测

4．2 试验结果

4．2．1 Z-9菌悬液对小麦种子荫发及促生长作用

4．2．2 Z-9菌剂对小麦全蚀病盆栽防治效果的测定

4．3 小结

4．4 讨论

第5章 结论

参考文献

在读期间发表论文

作者简历

致谢