二点委夜蛾高毒力苏云金芽胞杆菌杀虫毒素的筛选及其杀虫机理的研究

摘要

为了筛选对二点委夜蛾(Athetis lepigone Moschler)幼虫高毒力的苏云金芽胞杆菌杀虫毒素，采用生物测定的方法，分别对5株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)菌株和4种Bt毒素（Cry1 Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Vip3A）的杀虫活性进行了评价，并对这些菌株的基因型进行了分析，筛选得到了对二点委夜蛾幼虫具有较高杀虫活性的菌株Bt SC-40和BtHD-73;在同样浓度下，对二点委夜蛾幼虫杀虫活性最高的是Cry1Ac和Cry1Ab蛋白，处理72h幼虫平均校正死亡率分别达到82.9％和79.2％，其次是营养期杀虫蛋白Vip3A，72h的致死率为50％，Cry2Ab杀虫活性最低，处理72h对幼虫仅有37.5％的致死率。Cry1Ab和Cry1Ac对二点委夜蛾幼虫的LC50分别为0.89μg/g和1.22μg/g。
　　为了明确Bt毒素的作用机理，提取了二点委夜蛾4龄幼虫中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles，BBMV)蛋白，通过点杂交方法验证了Cry1Ab和Cry1Ac毒素的作用标靶位于中肠BBMV上，通过Ligand blotting分析结合蛋白质谱鉴定，表明其结合蛋白为氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN)类蛋白。
　　利用透射电子显微镜(TEM)分别观察并比较了二点委夜蛾幼虫取食含有4种Bt毒素（Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Vip3A）的饲料后中肠细胞的病理学变化。中肠细胞的病理变化程度与毒素的毒力成正相关，Cry1Ab和Cry1Ac对细胞破坏速度较快，并且无论从细胞线粒体、内质网还是细胞核等角度来看均比另外两种毒素的破坏程度要大，而Cry2Ab和Vip3A毒素处理的中肠不仅发生病变较为缓慢而且处理72h细胞整体的病变部位较前两种毒素要少。

目录

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摘要

Abstract

1引言

1．1 苏云金芽胞杆菌的杀虫活性物质及其致病机理

1．2 Bt受体蛋白及昆虫抗性的研究进展

1．3 Bt毒素对昆虫中肠组织和细胞的病理学影响

1．4 转Bt基因植物的研究进展及存在的问题

1．5 二点委夜蛾

1．6 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 Bt菌株、毒素及抗体

2．1．2 供试昆虫

2．1．3 试剂和仪器

2．2 试验方法

2．2．1 Bt菌株杀虫基因型的鉴定

2．2．2 Bt菌株杀虫活性的测定及高毒力菌株LC50的测定

2．2．3 4种Bt毒素对二点委夜蛾幼虫杀虫活性的测定

2．2．4 Cry1Ab和Cry1Ac毒素对二点委夜蛾幼虫的毒力测定

2．2．5 二点委夜蛾4龄幼虫中肠BBMV蛋白的提取

2．2．6 二点委夜蛾中肠BBMV蛋白与Cry1Ac、Cry1Ab抗体的点杂交(Dot blotting)

2．2．7 中肠BBMV结合蛋白检测(Ligand blotting)

2．2．8 中肠BBMV结合蛋白鉴定

2．2．9 昆虫中肠前处理

2．2．10 透射电镜超薄切片的制备

3 结果与分析

3．1 Bt菌株的基因型及对二点委夜蛾幼虫的杀虫活性

3．2 Bt SC-40和Bt HD-73菌株对二点委夜蛾2龄幼虫的毒力比较

3．3 Bt菌株营养期杀虫蛋白对二点委夜蛾的杀虫活性

3．4 4 种Bt毒素的杀虫活性比较及Cry1Ab、Cry1Ac对二点委夜蛾幼虫的LCs50

3．5 Cry1Ab和HCry1Ac毒素的作用靶标

3．6 中肠BBMV蛋白SDS-PAGE分析及结合蛋白检测(Ligand blotting)

3．7 中肠受体蛋白质谱鉴定

3．8 取食Bt毒素后幼虫中肠的细胞病理变化

4 讨论

5结论

参考文献

作者简历

致谢