玫瑰黄链霉菌诱导黄瓜抗线相关WRKY基因的表达分析及其药效试验

摘要

根结线虫病是影响设施蔬菜产量和质量的主要病虫害之一，每年都给我国设施蔬菜的生产造成很严重的损失。虽然化学药剂的施用起到了一定的作用，但其长期和不当使用给人类和坏境带来了很大的安全隐患。生物防治因其绿色环保等优点越来越受到人们的关注。玫瑰黄链霉菌（Strempomyces roseoflavus）Men-myco-93-63是本实验室保存的一株拮抗链霉菌，该菌株及其水剂对多种重要的植物病原菌都具有较强的抑制作用，前期研究表明Men-myco-93-63对根结线虫也具有较好的防治作用，但其生防作用机制目前还不是很明确。本文以津优1号黄瓜苗为试验材料，利用RT-PCR扩增技术，对Men-myco-93-63处理前后，黄瓜幼苗不同时间不同组织中WRKY转录因子的表达情况进行了检测和分析，并检测了Men-myco-93-63片剂对黄瓜根结线虫病的防效以及其对土壤微生物区系的影响。具体结果如下:
　　1、米集河北省定州市西南合蔬菜棚中的黄瓜病株，分离根结线虫，提取DNA，利用ITS通用引物进行PCR扩增及测序，使用BLAST软件进行序列比对，将其鉴定为南方根结线虫（Meloidogyne incognita）。
　　2、通过RT-PCR扩增，筛选到6个与Men-myco-93-63抗线虫相关的WRKY转录因子，对这些转录因子在Men-myco-93-63水剂处理后，在黄瓜幼苗不同组织不同时间点的表达情况进行了检测，结果表明，在黄瓜幼苗不同组织中，6个WRKY基因的表达量会随处理时间的延长而发生变化。其中，WRKY24仅在黄瓜根组织中表达，其表达量较根结线虫处理稍高;WRKY17、WRKY23、WRKY48、WRKY49、WRKY55在根组织中的表达量与根结线虫处理比呈上调趋势，且WRKY17和WRKY48在24h达到表达高峰，WRKY23和WRKY49表达量变化不规律。在茎组织中，WRKY17、WRKY49、WRKY55基因的表达量较根结线虫处理高，其中，WRKY55的正调控作用在处理前期最为显著;WRKY23、WRKY48的表达量呈下调趋势。叶组织中，WRKY17、WRKY48、WRKY49、WRKY55的表达量相对于根结线虫处理上调，其中，WRKY23和WRKY49的上调作用较小;WRKY23基因受Men-myco-93-63水剂调控作用微小，表达量与根结线虫处理相近。Men-myco-93-63水剂对多数WRKY转录因子在根组织中的调控作用大于茎和叶组织。推测Men-myco-93-63水剂对黄瓜幼苗根、茎、叶组织中WRKY转录因子的调控作用在黄瓜防御根结线虫的过程中发挥了一定的积极作用，但生防菌对不同组织中不同WRKY转录因子的调控作用存在差异。
　　3、利用温室盆栽法和平板稀释法，测定Men-myco-93-63片剂对黄瓜根结线虫病的防效及其对土壤中微生物区系的影响。结果发现，Men-myco-93-63片剂对黄瓜根结线虫病具有良好的防效，1.0g/株和1.5g/株用量时防效分别为51.85％和55.56％，而淡紫拟青霉颗粒剂1.5g/株和Men-myco-93-63固体发酵物的防效分别为54.17％和50.00％。施药60d后，Men-myco-93-63片剂对植株根际土壤中微生物区系影响较大，1.0g/株用量的处理，细菌和放线菌数量分别比清水对照增加了225.45％和75.45％，真菌数量降低了66.43％，3种可培养微生物的总量比清水对照增加了195.35％，表明Men-myco-93-63片剂的施用可明显改善黄瓜根际土壤中微生物的结构。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 根结线虫病简介及其危害

1．2 线虫的防治

1．3 线虫的生物防治

1．3．1 常见的杀线微生物

1．3．2 生防微生物的杀线机理

1．3．3 生防微生物对土壤微生物区系的影响

1．3．4 生物杀菌剂的制剂类型

1．4 WRKY转录因子

1．4．1 WRKY转录因子的结构特点及分类

1．4．2 WRKY转录因子在植物发育及代谢过程中的作用

1．4．3 WRKY转录因子在植物衰老过程中的作用

1．4．4 WRKY转录因子在植物损伤过程中的作用

1．4．5 WRKY在植物抗病过程中的作用

1．4．6 WRKY转录因子在线虫侵染过程中的作用

1．5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 根结线虫

2．1．3 植物材料

2．2 试验仪器和主要试剂

2．2．1 试验仪器

2．2．2 试剂

2．2．3 培养基

2．3 试验方法

2．3．1 根结线虫的分子鉴定

2．3．2 根结线虫的分离及其二龄幼虫悬浮液的制备

2．3．3 Men-myco-93-63孢子悬浮液的制备

2．3．4 Men-myco-93-63水剂的制备

2．3．5 Men-myco-93-63对黄瓜WRKY基因表达的影响

2．3．6 Men-myco-93-63片剂的制备

2．3．7 Men-myco-93-63片剂对黄瓜根结线虫的防效

3 结果与分析

3．1 根结线虫的分子鉴定

3．1．1 根结线虫DNA的提取

3．1．2 ITS基因片段的获得

3．1．3 ITS序列比对

3．2 Men-myco-93-63对黄瓜不同组织中WRKY基因表达量的影响

3．2．1 黄瓜总RNA的提取

3．2．2 黄瓜幼苗WRKY基因的分离

3．2．3 WRKY基因的系统进化分析

3．2．4 黄瓜根组织中WRKY基因的表达分析

3．2．5 黄瓜茎组织中WRKY基因的表达分析

3．2．6 黄瓜叶组织中WRKY基因的表达分析

3．3 Men-myco-93-63片剂对设施黄瓜根结线虫病的防治

3．3．1 Men-myco-93-63片剂对南方根结线虫病的防效

3．3．2 Men-myco-93-63片剂对根际土壤中根结线虫数量的影响

3．4 Men-myco-93-63片剂对根际土壤中微生物结构的影响

3．4．1 Men-myco-93-63片剂对细菌数量的影响

3．4．2 Men-myco-93-63片剂对真菌数量的影响

3．4．3 Men-myco-93-63片剂对放线菌数量的影响

4 讨论

4．1 Men-myco-93-63对黄瓜不同组织中WRKY基因表达量的影响

4．2 Men-myco-93-63片剂对黄瓜根结线虫病的防效

4．3 Men-myco-93-63片剂对黄瓜根际土壤中微生物区系的影响

5 结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢