番茄溃疡病菌LAMP检测系统的建立及Z-L-22对该病害的防治效果

摘要

番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)生产中最为严重的细菌病害之一，病原菌为密执安棒状杆菌密执安亚种（Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis，Cmm）。该病自从1910年首次在美国密执安州的温室番茄上发现以来，发生频繁，现已广泛分布于世界各番茄产区。近年来该病害在我国的发生呈上升趋势。Cmm可随带病种子、病苗、病残体及土壤传播，形成初侵染，国内外尚无防治该病的有效方法。已报道的一些措施仅局限在一定程度上控制病害的发生和蔓延。因此建立灵敏可靠的检测措施和开发有效的防治方法对于控制该病害的发生和发展有重要的意义。本研究建立了番茄溃疡病菌基于ITS序列的LAMP快速检测方法，并对番茄溃疡病菌拮抗菌株西唐链霉菌Z-L-22对病害的防治效果进行了研究。
　　1、以SYBR GreenⅠ为指示剂，建立了番茄溃疡病菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。根据番茄溃疡病菌特异的核糖体转录间隔区序列设计了4条引物进行LAMP扩增，通过对体系中各成分进行优化，最终确定25μL反应体系中模板200 ng，MgSO4的适宜浓度为3.0 mmol/L，Bst DNA聚合酶2U，dNTPs的适宜浓度为0.3mmol/L，外引物与内引物之比为1∶3时扩增效果较好，在65℃最佳反应时间为40 min。在优化的体系条件下，获得的反应产物经SYBR GreenⅠ染色后肉眼观察检测灵敏度可达到50 cfu/mL，优于琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度(500 efu/mL)，且对番茄溃疡病菌的检测具有高度的特异性。结果表明，该方法快速、准确、灵敏、特异，具有良好的实用性。
　　2、以一株对番茄溃疡病防治效果良好的西唐链霉菌菌株(Streptomyces setonii)Z-L-22为研究对象，开发出三种应用剂型—发酵液、发酵固体和片剂，并在温室和田间分别开展了对番茄溃疡病的防治。温室试验结果表明，10×发酵液稀释液、固体发酵物5 g和片剂1 g于番茄定植时施用可达到80％以上的防效;棚室防治结果表明Z-L-22在根际土壤中有良好的定殖能力，番茄定植75 d后，经过水剂、颗粒剂、片剂处理后的番茄发病率和严重度均显著低于硫酸链霉素处理和空白对照。其中片剂表现出运输、使用方便，持效期长、计量准确等优点，为利用该菌株防治番茄溃疡病提供了依据。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 番茄溃疡病的研究进展

1．1．1 番茄溃疡病的发生情况

1．1．2 番茄溃疡病病原菌及其生物学特性

1．1．3 番茄溃疡病的症状

1．1．4 病害的流行和传播

1．2 番茄溃疡病菌Cmm的快速检测研究进展

1．2．1 半选择性培养基

1．2．2 血清学检测技术

1．2．3 经典PCR方法

1．2．4 巢式PCR(nested PCR)检测方法

1．2．5 多重PCR(multiplex PCR)检测方法

1．2．6 实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR)检测方法

1．2．7 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测方法

1．2．8 免疫捕捉PCR(Immunocapture PCR)检测方法

1．2．9 基于基因组分析的检测方法

1．3 番茄溃疡病菌的防治

1．3．1 植物检疫

1．3．2 农事管理

1．3．3 物理防治

1．3．4 化学防治

1．3．5 番茄溃疡病的生物防治

1．4 微生物农药研究

1．4．1 微生物农药的应用现状及面临的问题

1．4．2 微生物农药剂型开发

1．5 本研究的目的和意义

1．5．1 建立番茄溃疡病菌LAMP快速检测方法

1．5．2 西唐链霉菌Z-L-22应用剂型的开发和田间防病试验

2 番茄溃疡病菌LAMP快速检测方法的建立

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株来源

2．1．2 主要试剂

2．1．3 菌体培养收集及DNA模板制备

2．1．4 LAMP引物的设计

2．1．5 LAMP反应体系优化

2．1．6 灵敏度检测

2．1．7 特异性验证

2．2 结果与分析

2．2．1 LAMP引物设计

2．2．2 LAMP反应体系的优化

2．2．3 灵敏度检测

2．2．4 特异性验证

3 西唐链霉菌Z-L-22应用剂型的开发和田间防病试验

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 主要培养基及仪器

3．1．3 生防制剂的制备

3．1．4 生防制剂温室防效试验

3．1．5 生防制剂田间防效试验

3．2 结果与分析

3．2．1 片剂营养组分配比筛选

3．2．2 固体剂型稳定性检测

3．2．3 温室药效试验调查结果

3．2．4 田间试验结果

4 讨论

4．1 Cmm快速检测方法的建立

4．2 番茄溃疡病生物防治

5 全文结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢