RNA干扰沉默STAT3基因对TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响及其机制研究

摘要

背景：肺纤维化(Pulmonary Fibrosis，PF)是初期表现为肺泡炎症，随后炎症、细胞因子和生长因子等多种因素导致肺组织的异常修复，表现为肺间质细胞增殖，分泌大量的细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)在肺泡腔内沉积，最终导致肺结构不可逆重构的疾病。成纤维细胞(Fibroblast，FB)向肌成纤维细胞(Myofibroblast，MB)转化是PF的发展的关键环节。MB特征性表达α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin，α-SMA)，是合成胶原和ECM的主要细胞并与ECM的沉积有关。转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)可以诱导FB向MB转化，是关键的致纤维化因子。信号转导和转录激活子3(Signal Transducers and Activators of Transcription 3，STAT3)是细胞内重要的转录调节因子，它可被多种细胞因子和生长因子激活，活化的STAT3进入核内调控靶基因转录，调节机体生理和病理过程。STAT3在肺纤维化中的作用尚未阐明。
　　 目的：构建表达RNA干扰片段的质粒沉默STAT3基因表达并研究沉默STAT3基因对TGF-β1诱导的FB向MB转化的影响及作用机制，为PF新药的开发和临床治疗奠定理论和实验基础。
　　 方法：合成针对STAT3mRNA的2条短发夹DNA和一条作为阴性对照的STAT3mRNA非同源序列DNA，分别插入pSilencerTM4.1-CMVneo质粒构建表达RNA干扰片段的重组质粒S1RNA-ST3-1，2，N。HFL-Ⅰ细胞培养至对数生长期，所有实验均采用5-7代细胞。5μg·L-1TGF-β1刺激0h、6h、12h、24h、48h、72h后，RT-PCR法检测Collagen-Ⅲ、STAT1、PIAS1、STAT3和PIAS3mRNA表达，刺激0d、1d、3d、5d后，WesternBlot法检测STAT1、STAT3和pSTAT3蛋白表达。SiRNA表达质粒转染治疗分为6组，正常对照组组(BC)；5μg·L-1TGFβ1组(T)；转染试剂组(NC)；SiRNA-ST3-N质粒组(SN)；5μg·L-1TGF-β1+SiRNA-ST3-1质粒组(S1+T)；5μg·L-1TGF-β1+SiRNA-ST3-2质粒组(S2+T)。TGF-β1与转染质粒同时加入。24h和48h后，RT-PCR法检测各组细胞中α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、STAT1、PIAS1、STAT3、PIAS3mRNA表达，Westernblot法检测各组细胞中α-SMA、Collagen-Ⅰ、STAT1、STAT3和pSTAT3蛋白表达。
　　 结果：
　　 1.重构质粒SiRNA-ST3-1，2，N测序结果与设计相符，SiRNA-ST3-1，2转染TGF-β1诱导HFL-I后能有效抑制STAT3mRNA和蛋白表达。
　　 2.HFL-Ⅰ细胞经5μg·L-1TGF-β1诱导后，Collagen-Ⅲ和STAT3表达均明显上调(P<0.05)，STAT1、PIAS1和PIAS3的表达则明显下调(P<0.05)。
　　 3.用沉默STAT3基因的质粒转染5μg·L-1TGF-β1诿导HFL-Ⅰ细胞，α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和STAT3mRNA的表达明显下降(P<0.05)，STAT1、PIAS1和PIAS3mRNA的表达则明显上升(P<0.05)。
　　 4.用沉默STAT3基因的质粒转染5μg·L-1TGF-β1诱导HFL-Ⅰ细胞，α-SMA、Collagen-Ⅰ、STAT3和pSTAT3蛋白表达明显下降(P<0.05)，STAT1蛋白表达则明显上升(P<0.05)。
　　 结论：STAT1、PIAS1、STAT3和PIAS3参与TGF-β1诱导FB向MB转化的调控。阻断STAT3基因表达能够抑制TGF-β1诱导FB向MB转化，其机制与降低Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ表达和减少STAT3磷酸化，升高STAT1、PIAS1和PIAS3表达有关。