猪三种主要繁殖障碍病原多重PCR检测方法的建立

摘要

目前猪瘟(Classical swine fever virus，CSFV)、猪伪狂犬(Porine pseudorabies virus，PRV)、猪繁殖与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是导致猪繁殖障碍疫病的主要病原。这三种病原常出现混合感染，增加了鉴别诊断难度。多重PCR方法具有特异性好、敏感性高且可同时检测多种病原的优点更适于疫病诊断。
　　本实验针对CSFV、PRRSV和PRV的高保守区域设计了3对引物分别用于扩增其目的基因序列，扩增产物大小分别为570bp、232bp、173bp。对三个单一PCR方法分别进行了退火温度、引物浓度、酶浓度和Mg2+浓度的优化，最终确定退火温度为54℃，上下游引物(10μmol/L)加入量为1μL，酶（5μ/μL）加入量为0.5μL，Mg2+(25 mM)终浓度为3mM。在此基础之上，建立了检测PRRSV和PRV的双重PCR方法及检测CSFV、PRRSV和PRV的多重PCR方法。经条件优化后的双重PCR方法退火温度为54℃，PRRSV和PRV上下游引物(10μmol/L)最佳用量为1μL，酶（5μ/μL）加入量为0.5μL，Mg2+(25 mM)终浓度为4mM。多重PCR检测方法的反应条件中退火温度确定为54℃，Mg2+(25 mM)终浓度确定为5mM，各上下游引物(10μmol/L)加入量确定为1μL，酶(5μ/μL)加入量为1μL。该方法可以检测到的CSFV、PRRSV和PRV最低含量分别为23.88pg、13.1pg、14.6pg。
　　利用本试验所建立的多重PCR检测方法对从河北省9个市县收集的168份临床出现繁殖障碍症状猪的组织样品进行检测。结果显示，CSFV、PRRSV、PRV的单纯感染分别为41例、36例和11例，阳性率分别为24.4％、21.4％和6.6％。CSFV与PRRSV、PRRSV与PRV、CSFV与PRV的混合感染分别为10例、1例和2例，阳性率分别为5.9％、1.2％与0.6％。CSFV、PRRSV与PRV混合感染有1例。说明猪场猪群中普遍存在猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症和猪伪狂犬病，同时提示我们要对猪瘟与猪繁殖与呼吸综合症引起重视并加强防疫。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 猪瘟研究现状

1．1．1 猪瘟病毒的分子生物学特征

1．1．2 猪瘟病毒致病机制

1．1．3 猪瘟病毒的诊断

1．2 猪繁殖与呼吸综合症研究现状

1．2．1 猪繁殖与呼吸综合症病毒分子生物学特征

1．2．2 猪繁殖与呼吸综合症病毒致病机制

1．2．3 猪繁殖与呼吸综合症病毒的诊断

1．3 猪伪狂犬研究现状

1．3．1 猪伪狂犬病毒分子生物学特征

1．3．2 猪伪狂犬病毒致病机制

1．3．3 猪伪狂犬病毒诊断

1．4 研究的目的及意义

2 材料

2．1 病毒和细菌毒株

2．2 病料采集

2．3 主要仪器

2．4 主要试剂

3 方法

3．1 试剂配制

3．2 引物的设计与合成

3．3 细胞复苏与培养

3．4 病毒的增殖

3．5 病原体RNA、DNA的提取

3．5．1 PRV DNA的提取

3．5．2 CSFV及PRRSV RNA的提取

3．6 病原体RNA反转录为cDNA

3．7 单一PCR检测方法的建立

3．8 PCR产物纯化与回收

3．9 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备-CaCl2法

3．10 目的基因与pMD19-T载体连接

3．11 连接产物的转化

3．12 重组质粒的提取

3．13 重组质粒的酶切鉴定

3．14 序列测定

3．15 单一PCR反应条件的优化

3．16 双重PCR检测方法的建立

3．17 双重PCR反应条件的优化

3．18 多重PCR方法的建立

3．19 多重PCR反应条件的优化

3．20 多重PCR检测方法特异性试验

3．21 多重PCR检测方法敏感性试验

3．22 重复性试验

3．23 临床样品检测

4 结果

4．1 单一PCR方法建立的结果

4．2 重组质粒酶切鉴定结果

4．3 序列测定及分析

4．4 单一PCR反应条件的优化结果

4．4．1 单一PCR反应退火温度优化结果

4．4．2 单一PCR反应Mg2+优化结果

4．4．3 单一PCR反应引物优化结果

4．4．4 单一PCR反应聚合酶浓度优化结果

4．5 双重PCR方法的建立结果

4．6 双重PCR反应条件优化结果

4．6．1 PRRSV和PRV双重PCR Mg2+浓度优化结果

4．6．2 PRRSV和PRV双重PCR聚合酶浓度优化结果

4．6．3 PRRSV和PRV双重PCR引物浓度优化结果

4．7 多重PCR方法的建立结果

4．8 多重PCR反应条件的优化结果

4．8．1 多重PCR反应Mg2+浓度优化结果

4．8．2 多重PCR反应聚合酶浓度优化结果

4．8．3 多重PCR反应引物浓度优化结果

4．9 多重PCR方法特异性试验结果

4．10 多重PCR方法敏感性试验结果

4．11 多重PCR方法重复性试验结果

4．12 临床样品检测结果

5 讨论

5．1 多重PCR方法

5．2 多重PCR引物的设计

5．3 多重PCR反应条件的优化

5．4 多重PCR特异性与敏感性

5．5 多重PCR方法临床应用

5．6 多重PCR方法病料的选择

6 结论

参考文献

附录

作者简历

致谢