枣实时荧光定量PCR中内参基因的筛选及应用

摘要

实时定量PCR（Real time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）是基因表达分析中应用最广泛的技术之一。目前，枣基因组测序的完成给后续基因功能的研究提供了大量基础数据，而筛选合适的内参基因对于枣基因功能研究至关重要。本研究以‘冬枣’品种为试材，参考转录组测序结果及已报道的常用看家基因，选出了ACT1（肌动蛋白1）、His3（组蛋白去乙酰化酶）、PAIP（多聚腺苷酸结合蛋白）、SiR-Fd（亚硫酸盐还原酶）、TUA（微管蛋白α）、BTF3（转录因子3）、EF1γ（延伸因子γ）、EF1α（延伸因子α）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）9个候选内参基因，利用geNorm和NormFinder两个软件分析了这9个候选内参基因在不同试验条件下的稳定性。随后，本研究以田间患枣疯病树不同患病程度叶片（表观正常叶、花变叶及疯丛枝小叶）为材料，健树健叶为对照，利用筛选出的稳定内参，分析了不同处理叶片中光合作用及抗坏血酸(L-ascorbicacid，AsA)代谢相关基因的表达，同时测定了叶片的叶绿素含量、叶绿素荧光动力学参数和抗坏血酸含量。主要结果包括:
　　利用同源克隆技术，克隆获得了枣GAPDH基因。该基因包括1020bp的ORF，编码339个氨基酸残基，登录号为KP147910。该基因氨基酸序列与其他植物同源基因的相似性为87％-90％，具有GAPDH基因的2个保守结构域。
　　通过Ct值比较、geNorm和NormFinder两个软件分析，在供试候选基因范围内筛选出了在枣果实不同发育时期、不同组织/器官、植原体侵染、黑暗处理和外源生长调节剂下稳定的内参基因。ACT1、His3和PAIP在果实的5个不同发育时期中表达稳定;ACT1和SiR-Fd在外界生长调节剂作用下表达稳定;ACT1、BTF3、GAPDH和PAIP在黑暗条件下表达稳定;ACT1、PAIP、BTF3和 EF1γ在植原体侵染情况下表达稳定;ACT1、SiR-Fd、BTF3和TUA在不同组织器官中表达稳定。其中，ACT1为所有供试条件下最稳定的内参基因，SiR-Fd和PAIP作为内参基因在本研究中首次报道。
　　利用筛选出的稳定和不稳定内参基因为内参，验证了内参基因的稳定性。使用稳定的和不稳定的内参基因作内参，分析了ZjGPP和ZjGGP在果实不同发育时期的表达、ZjRubisco和ZjRCA1在植原体侵染下不同患病程度叶片中的表达，结果表明，使用稳定内参基因得出的结果与理化分析及以往结果一致。
　　植原体侵染后，枣疯病树叶片光合作用受到了显著抑制。枣树患病后，不同患病程度叶片中叶绿素含量均下降;病叶中荧光参数qP和NPQ与健叶相比变化明显，而且病叶F。和Fm升高、Fv/Fm降低，上述结果表明病叶中PSⅡ活性受抑制。实时荧光定量PCR分析也表明，枣疯病病叶中光合相关的光能捕获基因ZjCBP的表达显著低于健树健叶，ZjRubisco、ZjRCA1和ZjRCA2的表达也严重受抑。
　　植原体侵染后，枣疯病树叶片抗坏血酸(AsA)合成受抑。利用高效液相色谱技术测定了植原体侵染后不同患病程度叶片和健树健叶的抗坏血酸含量，结果表明，健树健叶和病叶中AsA含量变化趋势一致，但病树叶片中AsA含量明显低于健树健叶。实时荧光定量PCR分析也表明，AsA合成基因ZjGGP、ZjGPP和ZjGLDH在病叶中表达受抑。

目录

声明

摘要

缩略词索引表

1 引言

1．1 枣产业的发展现状

1．1．1 枣产业的地位

1．1．2 枣的营养和经济价值

1．2 实时定量PCR

1．2．1 RT-qPCR的原理

1．2．2 RT-qPCR的定量方法

1．3 内参基因的筛选

1．3．1 内参基因的研究现状

1．3．2 内参基因的分析方法

1．4 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 克隆基因所用试材

2．1．2 内参基因筛选及验证材料

2．1．3 内参基因的应用所用材料

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 试验方法

2．4．1 ZjGAPDH基因的克隆及生物信息学分析

2．4．2 内参基因的筛选及验证

2．4．3 枣疯病树不同患病程度叶片生理指标的测定及实时定量PCR分析

3 结果与分析

3．1 ZjGAPDH基因的克隆及生物信息学分析

3．1．1 总RNA的提取与检测

3．1．2 枣GAPDH基因cDNA的获得

3．1．3 枣ZjGAPDH基因的生物信息学分析

3．2 内参基因的筛选及验证

3．2．1 候选内参基因的确定与引物的特异性

3．2．2 候选内参基因的扩增效率

3．2．3 候选内参基因的表达稳定性分析

3．2．4 通过RT-qPCR对筛选的内参基因进行验证

3．3 植原体侵染对枣树光合和抗坏血酸代谢的影响

3．3．1 植原体侵染后不同患病程度枣叶片的病原检测

3．3．2 植原体侵染后枣树抗病防御相关基因的表达

3．3．3 植原体侵染对枣树光合作用的影响

3．3．4 植原体侵染对枣树叶片AsA代谢的影响

4 讨论

4．1 内参基因的筛选及验证

4．2 植原体侵染对枣树光合作用影响

4．3 植原体侵染对枣树AsA代谢的影响

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢