用免疫印迹(Western blot)技术检测水稻中的白叶枯病菌

摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，白叶枯病是危害水稻最为严重的细菌性病害，在过去的十几年中，多个水稻抗白叶枯病基因以及白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)的无毒基因的被克隆，水稻及Xoo的全基因组测序也已经完成，所以水稻-白叶枯病菌互作体系是植病研究的重要模式系统，建立并优化白叶枯病菌的检测方法具有重要的理论意义和应用价值。免疫印迹(Western blot，WB)技术有使用方便、特异性强、灵敏度高、假阳性率低等特点，在植物和动物病原物检测中有重要的实用意义。
　　本研究以Xoo全蛋白质为免疫原，制备了Xoo多克隆抗体，该抗体能够识别所有受检的Xoo小种，没有Xoo小种特异性，与水稻、稻瘟病菌和大肠杆菌样品没有交叉反应，所制备的抗体具有Xoo特异性。本研究建立了检测Xoo的WB技术，检测下限约为3500个Xoo细胞，并且WB信号与Xoo的量在一定范围内有线性关系。水稻接种Xoo菌后5-7天表型可见水稻感病，在本实验中，用WB方法检测Xoo，在人工接种Xoo后第一天，即可检测到水稻中的Xoo，在接种后第2天，即可检测到抗感反应中Xoo数量的显著区别。在水稻-Xoo不亲和反应中，接种后10天，Xoo仅存在于接种部位附近(6cm)的范围内，在水稻-Xoo亲和反应中，接种后10天，可在接种部位12cm范围内检测到Xoo，而在距离接种部位更远的叶片和非接种叶片中，均不能检测到Xoo信号，说明抗病水稻品种对Xoo的繁殖具有更强的抑制作用。
　　免疫学技术为检测Xoo在水稻中的繁殖提供了一个新的选择，本文建立的免疫印迹方法，操作可在一天内完成，可望替代实验室常用的剪叶计数方法，为鉴定水稻受Xoo的侵染以及水稻-Xoo互作研究提供了有应用价值的方法。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 水稻白叶枯病菌(Xoo)的概述

1．1．1 水稻自叶枯病菌(Xoo)的发现、分类及分布

1．1．2 Xoo的形态学特征

1．1．3 Xoo的无毒基因

1．1．4 Xoo的侵染与传播

1．2 白叶枯病菌的检测方法

1．2．1 传统检测方法

1．2．2 PCR检测方法

1．2．3 免疫学检测方法

1．3 免疫印迹(Western blot，WB)技术在植物病原物检测中的优势

1．4 研究意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 水稻材料

2．1．2 白叶枯病菌及其它菌株

2．1．3 主要试剂和用品

2．1．4 仪器与设备

2．2 水稻种植与取材

2．2．1 水稻的种植

2．2．2 培养水稻白叶枯病菌

2．2．3 接菌及取材

2．3 总蛋白的提取

2．3．1 水稻叶片材料的蛋白质提取

2．3．2 Xoo总蛋白质的提取

2．3．3 其它菌总蛋白质的提取

2．4 Xoo菌落计数

2．5 多克隆抗体的制备、ELISA分析及WB鉴定

2．5．1 多克隆抗体的制备

2．5．2 ELISA测定抗体效价

2．5．3 WB鉴定Xoo抗体的可用性

2．6 WB分析及信号采集

2．6．1 WB检测

2．6．2 数据分析及归一化处理

3 结果与分析

3．1 Xoo蛋白质的提取与检测

3．2 Xoo抗体的制备与评价

3．3 Xoo抗体的可用性与效价的验证

3．4 Xoo抗体特异性鉴定

3．5 Xoo抗体的灵敏度鉴定及标准曲线绘制

3．6 用WB定量检测不同互作反应中的Xoo

3．7 用WB检测Xoo在水稻叶片中的分布

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢