一个新的小麦富半胱氨酸受体激酶基因在抗叶锈病中的功能研究

摘要

植物富半胱氨酸受体蛋白激酶属于植物类受体蛋白激酶家族，关于该家族在小麦中的研究报道还很少。本试验以小麦近等基因系TcLr26和Thacher（以下简称Tc）分别与叶锈菌生理小种260组成不亲和与亲和组合，在不亲和组合中表现典型的细胞过敏性死亡(hypersensitive reaction，HR)现象。基于本实验室对该互作体系的RNA-Seq高通量测序数据库，通过基因差异表达分析，筛选到了一个在接种后较0h表达明显上调的Unigene(GeneID:CL13444.Contig1_All)，运用PCR技术结合RACE技术从TcLr26中克隆得到其CDS全长。通过生物信息学及系统进化树分析，将该基因命名为TaCRK2。利用实时定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)对TaCRK2基因在TcLr26接种叶锈菌后的表达模式进行了初步分析，结果显示该基因在接种后呈持续上调表达趋势，意味着TaCRK2基因与TcLr26抵抗叶锈菌的侵染过程有密切关系。采用VIGS和RNAi技术对TaCRK2基因在TcLr26抵抗叶锈菌小种260侵染诱发的HR中的作用进行了研究，并通过幼穗转化法获得在Tc中过表达TaCRK2基因的阳性株系，接种试验证明了该基因的过表达提高了Tc的抗叶锈性。本试验获得的主要结果如下:
　　1.利用PCR和5'RACE技术从近等基因系TcLr26中克隆得到TaCRK2的CDS全长。该基因全长1482bp，编码493个氨基酸，其蛋白包含一个信号肽，胞外有两个CRKs家族典型的DUF26结构域（即两个C-X8-C-X2-C基序），一个跨膜结构域和一个丝/苏氨酸蛋白激酶结构域。
　　2.利用RT-qPCR检测了不同亲和性组合中TaCRK2基因的表达模式，结果显示该基因在不亲和组合中自接种后8h呈持续上调的表达趋势，至48h其表达量达到了0h的9.45倍;而亲和组合中，TaCRK2的表达量在0-48h几乎没有变化。初步证明TaCRK2基因参与了小麦抵抗叶锈菌侵染的过程。
　　3.利用VIGS技术和RNAi技术沉默TcLr26中的TaCRK2基因后再接种叶锈菌小种260，结果表明，在单侵染点处发生HR的细胞面积和吸器母细胞(haustorialmother cell，HMC)的数量较对照增多，接种后15天左右可在叶片表面观察到叶锈菌的夏孢子堆，且RNAi植株叶片上出现的孢子堆数量也较VIGS叶片多。另外，还发现RNAi转化植株在接种后24h HR细胞才刚刚出现，相比未转化植株延迟了8～12h。这些结果表明，TaCRK2基因在叶锈菌侵染小麦诱发的过敏性反应中起到了重要的正调控作用，TaCRK2基因的沉默降低了TcLr26对叶锈菌的抗性。
　　4.构建了TaCRK2基因的过表达载体，利用农杆菌介导的幼穗法转化体系对Tc进行遗传转化，获得阳性过表达植株。在T1代TaCRK2过表达植株上接种叶锈菌小种260，在侵染点处或非侵染点处均可观察到HR，同时发现菌的发育受到极大限制，接种后15天左右在叶片上没有出现叶锈菌的夏孢子堆。由此可见，TaCRK2基因的过表达大大提高了Tc对叶锈菌的抗性。
　　5.对小麦TcLr26外源喷施SA后，TaCRK2基因被大量诱导表达，说明TaCRK2基因可能参与了SA信号通路，并在SA信号下游发挥作用。
　　6.不同近等基因系接种叶锈菌小种260后，TaCRK2基因在三个不亲和组合中（TcLr1、TcLr19和TcLr21接种叶锈菌小种260）12h之前的表达量呈逐渐增加趋势，且在8h或12h出现表达高峰，表达量达到0h的4倍至20多倍不等;而在亲和组合中（TcLr10接种叶锈菌小种260）该基因的表达在此时间区段虽也呈递增趋势，但其表达量远远低于不亲和组合，说明在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中TaCRK2基因参与了基础防卫反应的诱发，且在其中发挥正调控作用。在接种16h之后，TaCRK2基因在三个不亲和组合中的表达趋势不同，在TcLr1和TcLr21形成的组合中仍有较高水平的表达，说明该基因有可能也介导了抗叶锈基因Lr1或Lr21诱发的防卫反应，即HR-PCD过程;但在TcLr19中在接种16h之后其表达量却降至0h水平，意味着该基因没有介导Lr19诱发的防卫反应。说明TaCRK2基因在不同的Lr基因背景下所发挥的作用是不同的。

目录

声明

摘要

Abbreviations

1 引言

1．1 小麦抗叶锈病研究进展

1．1．1 小麦叶锈病危害

1．1．2 叶锈菌侵染小麦的过程与细胞过敏性反应

1．1．3 生产上控制小麦叶锈病的策略

1．2 小麦抗叶锈病基因研究进展

1．2．1 植物抗病机制

1．2．2 植物抗病基因研究现状

1．2．3 小麦抗叶锈基因研究

1．3 转录组测序在植物抗病基因挖掘中的应用

1．4 本试验内容的提出及研究意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试小麦及叶锈菌

2．1．2 供试菌株与质粒载体

2．1．3 主要实验药品与试剂

2．1．4 培养基

2．1．5 主要仪器设备及耗材

2．1．6 引物及DNA测序

2．2 试验方法

2．2．1 CL13444．Contig1_All基因的克隆

2．2．2 CL13444．Contig1_All基因鉴定及编码蛋白特征和系统进化分析

2．2．3 小麦与叶锈菌互作过程中TaCRK2在转录水平的表达分析

2．2．4 TaCRK2在小麦TcLr26植株中的组织表达分析

2．2．5 TaCRK2基因VIGS载体的构建及转染小麦

2．2．6 TaCRK2基因沉默效率检测及功能分析

2．2．7 TaCRK2基因RNAi载体的构建

2．2．8 利用农杆菌介导的幼穗法进行RNAi载体的遗传转化

2．2．9 T1代RNAi阳性植株的鉴定及功能分析

2．2．10 TaCRK2基因过表达载体的构建及遗传转化

2．2．11 SA处理TcLr26后对TaCRK2基因表达的影响

2．2．12 TaCRK2基因在其他近等基因系中的表达情况

3 结果与分析

3．1 转录组库中CL13444．Contig1_All基因的克隆

3．1．1 总RNA的完整性、含量及纯度检测

3．1．2 CL13444．Contig1_All基因转录组已知序列的验证

3．1．3 5’RACE扩增CL13444．Contig1_All基因的CDS序列

3．2 CL13444．Contig1_All基因全长序列和编码蛋白的特性

3．3 小麦与叶锈菌互作过程中TaCRK2基因的RT-qPCR分析

3．4 TaCRK2基因在小麦不同组织中的表达分析

3．5 VIGS技术初步探究TaCRK2基因功能

3．5．1 TaCRK2基因VIGS载体构建及体外转录

3．5．2 基因沉默后的检测

3．5．3 沉默TaCRK2基因对HR和叶锈菌发育的影响

3．6 TaCRK2基因RNAi载体的构建及转基因小麦的获得

3．6．1 TaCRK2基因RNAi载体的构建

3．6．2 农杆菌介导的幼穗法遗传转化

3．6．3 PCR检测RNAi-TaCRK2阳性植株

3．6．4 RNAi-TaCRK2植株的沉默效率检测

3．6．5 TaCRK2基因沉默后对HR和叶锈菌发育的影响

3．7 TaCRK2-GUS过表达载体的构建及遗传转化

3．7．1 TaCRK2-GUS过表达载体的构建

3．7．2 农杆菌介导的幼穗法对TaCRK2基因过表达载体遗传转化

3．7．3 TaCRK2过表达转基因植株PCR检测

3．7．4 RT-qPCR检测OE植株中TaCRK2的表达量

3．7．5 TaCRK2基因过表达对HR和叶锈菌发育的影响

3．8 外源水杨酸对TaCRK2基因表达的影响

3．9 不同近等基因系与叶锈菌互作过程中TaCRK2基因的转录水平表达

4 讨论

4．1 关于TaCRK2的克隆和命名

4．2 TaCRK2基因在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中的作用

4．3 TaCRK2基因的应用前景

4．4 下一步研究计划

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢