绵羊多胎性状差异表达microRNA的筛选与靶基因验证

摘要

小尾寒羊产羔率高，平均产羔率为281.9％，而吐鲁番黑羊是典型的产单羔绵羊，单羔率为99.3％。多胎性状是绵羊的重要经济性状之一，是决定繁殖率的关键因素之一。然而，多胎性状是受多基因控制的且遗传力低，利用传统的选择方法培育新的高繁殖率品种是相当繁琐的。构建小尾寒羊和吐鲁番黑羊卵巢组织miRNA表达谱，筛选与绵羊多胎性状相关的miRNAs，为培育新高繁殖率品种提供新的方向。
　　本研究采用高通量测序技术，构建了小尾寒羊和吐鲁番黑羊发情期、间情期四个卵巢组织样品的miRNA cDNA库。结果表明:四个样品组织分别获得了11467290、10667271、11133001、10793522条纯净reads;对这些reads进行长度分布统计，在22nt处达到峰值;采用miRDeep程序对测序结果进行分析，在四个卵巢样品中分别获得194、191、188、187个miRNAs，其中已知miRNA分别为135、134、136、129个，未知miRNA分别为59、57、52、58个;oar-miR-99a是小尾寒羊间情期表达量最为丰富的miRNA，而oar-miR-143是小尾寒羊发情期、吐鲁番黑羊发情期和间情期三个样品中表达量最丰富的miRNA。通过对同一个体发情期和间情期表达的miRNAs进行比较，筛选出小尾寒羊发情期与间情期中3个显著差异表达的miRNAs（log2Foldchange＜-1），吐鲁番黑羊发情期与间情期存在19个显著差异表达miRNAs（log2Foldchange＜-1），对其靶基因进行GO富集和KEGG通路分析，推测差异表达的miRNAs通过代谢和免疫途径调控绵羊相关的繁殖过程;通过多胎与单胎羊之间的比较，筛选出小尾寒羊与吐鲁番黑羊间情期之间34个差异表达的miRNAs（log2Foldchange＜-1），推测这些miRNAs与绵羊多胎性状相关，为培育新的高繁殖率品种提供新的方向和思路。
　　采用荧光素酶报告分析实验对miR-150、miR-27a进行靶基因的验证。试验结果表明:StAR基因为miR-150的一个靶基因，而CREB1不是miR-27a的靶基因。StAR为固醇类激素生成过程中重要的限速酶，推测miR-150是通过作用于StAR影响孕酮的生成，从而对绵羊的卵泡发育、排卵、排卵数、产羔率产生调节作用。而miR-27a不是通过CREB1调节绵羊的繁殖活动。
　　利用实时荧光定量PCR检测oar-miR-23b、oar-miR-200b、oar-miR-150、oar-miR-19b、oar-miR-194、oar-miR-200a、oar-miR-27a、oar-miR-143在小尾寒羊和吐鲁番黑羊间情期与发情期4个卵巢样品中的表达量，试验结果表明:实时荧光定量PCR与高通量测序表达量相同，验证了高通量测序的准确性。

目录

声明

论文说明

摘要

1 引言

1．1 miRNA的发现

1．2 miRNA的生成

1．3 miRNA的作用机制

1．4 miRNA的检测方法

1．4．1 Northern blot

1．4．2 Real-time PCR

1．4．3 芯片

1．5 miRNA与高通量测序

1．6 miRNA与繁殖的关系

1．6．1 哺乳动物卵巢组织miRNA表达谱研究

1．6．2 miRNA调控卵泡发育过程

1．7 靶基因预测的方法

1．8 miR-27a与miR-150的功能

1．9 miR-27a与miR-150在小尾寒羊和吐鲁番黑羊卵巢组织中的表达

1．10 CREB1与StAR基因在繁殖中的作用

1．11 本实验的研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 主要耗材及仪器

2．2 生物信息分析参考的数据库和分析程序

2．3 试剂配置方法

2．4 差异表达miRNAs的筛选

2．4．1 样品的采集

2．4．2 总RNA的提取

2．4．3 总RNA质量检测

2．4．4 文库构建与测序

2．4．5 生物信息学分析

2．4．6 real-time PCR验证差异表达的miRNAs

2．5 靶基因的验证

2．5．1 miRNA靶基因野生型和突变型序列的设计与合成

2．5．2 miRNAmimic的合成

2．5．3 重组载体构建

2．5．4 293T细胞培养及转染

2．5．5 数据处理

3 结果

3．1 差异表达miRNAs筛选

3．1．1 总RNA的质量检测

3．1．2 原始序列数据

3．1．3 测序数据的质量评估

3．1．4 测序数据过滤

3．1．5 sRNA长度筛选

3．1．6 公共及特有序列分析

3．1．7 sRNA与参考序列进行比对

3．1．9 碱基偏向性

3．1．10 匹配上的已知miRNA的表达情况

3．1．11 新miRNA预测

3．1．12 sRNA分类注释统计

3．1．13 差异表达miRNAs的筛选

3．1．14 差异miRNAs的靶基因预测和GO功能注释

3．1．15 差异miRNAs靶基因KEGG富集分析

3．1．16 qRT-PCR验证结果

3．2 靶基因验证结果

3．2．1 PGL3-control酶切后的检测

3．2．2 筛选阳性克隆

3．2．3 293T细胞最佳转染效率及pGL3-control与PRL-TK比例的确

4 讨论

4．1 表达谱

4．2 小尾寒羊间情期与发情期差异表达miRNAs分析

4．3 吐鲁番黑羊间情期与发情期差异表达miRNAs分析

4．4 小尾寒羊间情期与吐鲁番黑羊间情期差异表达miRNAs分析

4．5 靶基因预测中突变目的基因、mimic nagtive control及酶切位点磷酸化

4．6 miR-27a、miR-150作用机制

5 结论

参考文献

在读期间发表论文

作者简介

致谢