褪黑素对约束应激小鼠卵母细胞的保护作用

摘要

约束应激会造成卵母细胞的氧化应激，并进一步导致卵母细胞的损伤，影响发育能力。褪黑素(melatonin，MT)是高效的抗氧化剂。在体外环境、老化、化学物质等诱发的卵母细胞和胚胎氧化应激中，适度的褪黑素处理可以有效清除活性氧族(reactive oxygen species，ROS)缓解氧化应激，改善卵母细胞和胚胎发育能力。因此，我们推测针对母体的褪黑素处理，可以缓解约束应激造成的卵母细胞损伤。本试验将以约束应激小鼠为模型，探究母体注射褪黑素对卵母细胞的保护作用。
　　试验对小鼠超排后的卵母细胞进行收集统计，观察约束应激和褪黑素对小鼠超排效果的影响。结果显示，与对照组相比，约束应激处理48小时后小鼠排卵数显著增加(P＜0.05)，而注射褪黑素后排卵数恢复至正常超排水平，表明约束应激增强了小鼠的超排反应，褪黑素能够对其进行有效地缓解。
　　通过检测卵母细胞活性氧水平、线粒体拷贝数、线粒体活性和膜电位，以此来评价褪黑素对约束应激小鼠卵母细胞质量的影响。结果显示，与对照组相比，约束应激后卵母细胞内ROS含量显著上升(P＜0.05)，线粒体拷贝数显著增加(P＜0.05)、线粒体活性显著降低(P＜0.05)、膜电位异常升高(P＜0.05)，而褪黑素处理后线粒体活性显著升高(P＜0.05)、膜电位显著降低(P＜0.05)，但拷贝数变化不显著(P＞0.05)。这些结果表明约束应激造成小鼠卵母细胞氧化应激，增加了线粒体的数量但同时对线粒体的功能造成损伤，影响了卵母细胞的质量，而母体注射褪黑素可以提高约束应激小鼠卵母细胞的质量。
　　利用卵母细胞体外受精技术并对获得的囊胚进行细胞数和凋亡染色，评价褪黑素对约束应激小鼠卵母细胞体外发育能力的影响。结果发现与对照组相比，约束应激小鼠卵母细胞体外受精后受精率和卵裂率并未显著降低（P＞0.05），但囊胚率和囊胚细胞数显著下降(P＜0.05)，并且凋亡的囊胚比例显著上升(P＜0.05)。注射褪黑素后可以显著提高囊胚率和囊胚细胞数，并且显著降低凋亡的囊胚比例（P＜0.05）。这些结果表明，约束应激会损伤小鼠卵母细胞受精后到附植前的发育能力，而褪黑素的使用提高了约束应激小鼠卵母细胞的体外发育能力。
　　上述试验结果证实:母体的约束应激会诱发异常的超排反应，并造成卵母细胞氧化应激，降低卵母细胞质量和体外发育能力。针对约束应激小鼠进行褪黑素注射，能有效缓解约束应激反应，改善卵母细胞质量，并提高卵母细胞体外发育能力。

目录

声明

论文说明

摘要

1．1 应激的概念

1．2 应激对畜牧生产的影响

1．3 应激对母畜生殖机能的影响

1．3．1 卵母细胞的发生和卵泡的形成

1．3．2 应激造成卵母细胞的损伤

1．3．3 应激对线粒体功能的影响

1．4 褪黑素缓解应激的研究进展

1．4．1 褪黑素的生物合成与调控

1．4．2 褪黑素的主要生理功能

1．4．3 褪黑素对应激的缓解作用研究现状

1．5 本试验的研究意义

2 材料和方法

2．1．2 试验试剂

2．2 试验动物

2．3 约束应激和褪黑素对小鼠排卵的影响

2．3．1 试验动物处理

2．3．2 卵母细胞的收集统计

2．4 褪黑素对约束应激小鼠卵母细胞质量的影响

2．4．1 试验动物处理

2．4．2 卵母细胞内活性氧水平检测

2．4．3 卵母细胞线粒体拷贝数的测定

2．4．4 线粒体Mito-Tracker染色及膜电位JC-1染色

2．5 褪黑素对约束应激小鼠卵母细胞体外发育的影响

2．5．1 试验动物处理

2．5．2 体外受精胚胎发育情况统计

2．5．3 囊胚细胞DAPI染色和TUNEL凋亡染色

2．6 数据分析

3 结果与分析

3．1 褪黑素有效缓解约束应激小鼠排卵的异常增加

3．2 褪黑素提高约束应激小鼠卵母细胞的质量

3．2．1 约束应激造成的小鼠卵母细胞内氧化应激水平升高

3．2．2 约束应激引起的小鼠卵母细胞线粒体拷贝数异常升高

3．2．3 褪黑素缓解约束应激造成的小鼠卵母细胞线粒体活性降低

3．2．4 褪黑素缓解约束应激引起的小鼠卵母细胞线粒体膜电位超极化现象

3．3 褪黑素提高约束应激小鼠卵母细胞体外受精的发育能力

3．3．1 褪黑素提高约束应激小鼠卵母细胞体外受精囊胚率

3．3．2 褪黑素改善约束应激小鼠卵母细胞体外受精囊胚质量

4．1 约束应激模型的确定

4．2 褪黑素有效缓解约束应激小鼠排卵异常增加的分析

4．3 褪黑素提高约束应激小鼠卵母细胞质量的分析

4．4 褪黑素提高约束应激小鼠卵母细胞体外受精发育能力的分析

5 结论

参考文献

在读期间发表论文情况

作者简历

致谢