人母乳源鼠李糖乳杆菌的分离及益生活性初步研究

摘要

国内外相关实验发现，人母乳中含有丰富多样的共生菌。这些乳汁中的微生物通过母乳喂养的方式传递给婴儿，从而促进其肠道微生物区系的建立和成熟。因此，从人母乳中筛选获得具有潜在益生性质的益生菌，对明确母乳中益生菌的功效及开发新型益生菌产品具有重要意义。本研究利用高通量测序技术分析两个母乳样品不同时期微生物组成和丰度，对母乳中的乳杆菌进行分离筛选，进一步研究筛选菌株体外益生活性，主要研究结果如下:
　　(1)以河北和北京地区两位顺产产妇产后10天-180天提供的48个母乳样本为材料，采用16S rDNA V3-V4可变区的Illumina高通量测序技术方法，研究了48个母乳样本微生物组成和丰度进行分析，主要研究结果为:河北产妇母乳样品鉴定出微生物隶属于40个门，北京产妇母乳样品微生物隶属于25个门，两组样品共鉴定出41个门，含量较高的有13个门，其中厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Protro bacteria）的含量最多，为优势菌门。在属水平上，河北产妇母乳样品鉴定出微生物隶属于665个属，北京产妇母乳样品微生物隶属于401个属，两组样品共鉴定出701个属，共有属为365个，含量较高的属为芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)均是两组样本中的优势菌群，48个母乳样品均检测到乳杆菌属(Lactobacillus)，含量在0.1％左右，产妇生产后第一个月的母乳样品河北组与北京组乳杆菌属含量为0.04％和0.06％;第二、三个月两个母乳乳杆菌属含量均有所增加，分别为0.3％和0.13％;第六个月时，乳杆菌属含量又降低到0.07％和0.04％。
　　(2)利用乳酸菌产酸特性，对母乳样品中的乳杆菌进行分离筛选。对筛选菌株进行形态学记录观察、生理生化试验及16S rDNA序列鉴定，结果在16株产透明圈疑似菌株中共分离得到一株镜检为革兰氏阳性，短杆状，无芽孢;生理生化特性符合鼠李糖乳杆菌的基本特征;16S rDNA序列及进化树分析进一步确认该菌株为鼠李糖乳杆菌，并命名为鼠李糖乳杆菌Z5菌株(Lactobacillus rhamnosus Z5)。
　　(3)以筛选得到的菌株为原料，采用体外模拟人胃肠道环境，对鼠李糖乳杆菌Z5进行了耐受性评价，在pH3.0的条件下模拟人工胃肠液共消化6h后该菌存活率达90％以上，在0.15g/L胆盐质量浓度培养6h，菌株存活率达76.14％;抑菌试验发现，菌株培养液对沙门氏菌及大肠杆菌两种常见致病菌的生长有较优的抑制效果。细胞黏附试验发现，该菌株可有效黏附到Caco-2细胞表面，对Caco-2细胞的平均黏附数为7.54×105cfu/mL。
　　从人母乳中获得了这株具有潜在益生性质的鼠李糖乳杆菌，为明确母乳中益生菌的功效及开发新型益生菌产品研究提供了良好的实验材料。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1 引言

1．1 目的意义

1．1．1 母乳中微生物的分离

1．1．2 母乳中微生物的生理作用

1．1．3 乳杆菌的益生作用

1．2 国内外研究进展

1．2．1 母乳中微生物的来源

1．2．2 母乳微生物构成的影响因素

1．2．3 分子生物学与生物信息学技术在人母乳微生物研究的应用

1．3 存在的主要问题

1．4 本研究的主要内容

1．5 技术路线

2．1 前言

2．2 实验试剂仪器与设备

2．3 实验方法

2．3．1 研究对象

2．3．2 取样方法

2．3．3 母乳样品的16s rDNA可变区的PCR扩增

2．3．4 数据处理及质量控制

2．3．5 统计学分析

2．4 实验结果与分析

2．4．1 样本筛选及编号

2．4．2 母乳微生物全基因组DNA的提取

2．4．3 样品测序深度及数据量

2．4．4 两名产妇母乳微生物群落分析

2．4．5 两名产妇母乳乳杆菌含量分析

2．5 讨论

2．6 本章小结

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 实验原料

3．2．2 实验常用培养基

3．2．3 实验试剂

3．2．4 实验仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 样品的采集与保存

3．3．2 母乳中乳酸菌的分离纯化

3．3．3 母乳中乳酸菌的筛选及保存

3．3．4 疑似菌株的鉴定

3．3．5 分子水平鉴定

3．4 结果与分析

3．4．1 母乳中乳酸菌的分离

3．4．2 个体形态及菌落特征

3．4．3 菌株生理生化特性

3．4．4 菌株16S rDNA序列扩增结果

3．4．5 基于16S rDNA序列系统进化树分析

3．5 讨论

3．6 本章小结

4 鼠李糖乳杆菌Z5体外益生活性评价

4．1 前言

4．2 实验材料与设备

4．2．1 实验试剂和材料

4．2．2 实验仪器与设备

4．3 实验方法

4．3．1 乳杆菌的活化及供试菌液的制备

4．3．2 Z5菌株生长曲线及pH值的测定

4．3．3 Z5菌株酸耐受能力的测定

4．3．5 Z5菌株耐人工胃、肠液能力的测定

4．3．6 Z5菌株抑菌活性分析

4．3．7 菌株与Caco-2细胞的黏附作用

4．4 数据处理

4．5 结果与分析

4．5．1 Z5菌株生长曲线及培养基pH变化情况

4．5．2 Z5菌株耐酸性试验结果

4．5．3 Z5菌株耐胆盐试验结果

4．5．4 Z5菌株耐模拟胃、肠液能力的结果

4．5．5 抑菌试验

4．5．6 与Caco-2细胞的粘附情况

4．6 讨论

4．7 本章小结

5．1 结论

5．2 创新点

参考文献

硕士期间发表学术论文

作者简历

致谢