花生资源黄酮含量分析和黄酮醇合成酶基因克隆

摘要

黄酮类化合物是花生种子中重要功能性成份，其含量高低影响花生的品质，继而影响花生的保健价值。目前，花生种子黄酮研究仅在黄酮种类鉴定、资源筛选及QTL初定位上有所报道，但对黄酮含量的鉴定及黄酮合成基因克隆等方面的深入研究较少。本研究通过测定花生品种中总黄酮含量筛选高黄酮种质;利用同源克隆法和RACE技术克隆花生黄酮醇合成酶(FLS)相关基因，并进行抗逆境响应和种子发育表达研究，确定与种子黄酮含量相关的FLS成员。
　　主要研究结果如下:
　　1.测定河北花生地方品种种子总黄酮含量，筛选到花生种子中总黄酮含量在3.50mg RT/g FW以上的种质8份:盐山乌鸦窝、任丘一窝猴、隆尧一窝猴、辛农一窝猴、香河一窝猴、滦平大花生、大名一把揪、芦龙小花生。花生种胚中总黄酮含量在0.60mg RT/g FW以上的种质两份:平山中粒、深县小拔果。
　　2.相关性分析表明花生黄酮含量与可溶性蛋白含量显著负相关(Pearson:-0.254，α=0.028，P＜0.05)，与每株荚果数显著负相关(Pearson:-0.244，α=0.034，P＜0.05)，与脂肪含量、株高、侧枝长、侧枝数、百果重、百仁重、网纹、果壳厚度等性状呈负相关，未达显著水平，与糖含量正相关不显著。
　　3.获得与花生种子总黄酮含量显著相关的4个EST-SSR:GM2284、GM2156、GM2067和GM1878，其中GM2156与花生种子总黄酮含量显著正相关，其它三个显著负相关。
　　4.从栽培花生种子中克隆到6个花生黄酮醇合成酶基因(AhFLSs)，生物信息学分析表明均含有FLS特征结构域:N-端的DIOX_N，C-端的2OG-FeⅡ_Oxy;6AhFLSs均为亲水蛋白质、无跨膜区和信号肽;将6个花生黄酮醇合成酶与其它植物FLS进行比对，AhFLSs与大豆的各FLS同源性最高，其次是蒺藜苜蓿。AhFLS1与大豆（XM_0035480333）的同源性在80％，AhFLS6与大豆和蒺藜苜蓿的同源性在75％。
　　5.测定花生幼苗期和开花期各器官、不同发育时期种子中的杨梅黄酮、槲皮素、山奈酚等三种黄酮醇含量。在花生的根、茎、叶、花及种子中，槲皮素含量高于杨梅黄酮和山奈酚，是主要的黄酮醇类物质。幼苗期的叶片中三种黄酮醇类物质含量高于根、茎;开花期的花中的黄酮醇类物质含量高于根、茎、叶;在种子发育及干燥后熟期，三种黄酮醇类物质含量持续上升，到完全干燥成熟期，达到最大值。荧光实时定量分析AhFLS2、AhFLS3、AhFLS4、AhFLS5、AhFLS6在各样品中的表达情况，在根、茎、叶、和花中，AhFLS2表达量最高，在种子开始膨大的R5到R8完全成熟期间，AhFLS4表达高于其它AhFLSs成员，进入干燥成熟期，AhFLS6表达量持续升高，高于其它AhFLSs成员，在三种黄酮醇类物质含量达到最高值的干燥后熟期达到最大值。结果表明各AhFLSs成员表达具有组织特异性和发育时间特异性。
　　6.低温、高温、盐、干旱、重金属、紫外线和激素处理花生幼苗，测定其杨梅黄酮、槲皮素、山奈酚等三种黄酮醇含量，槲皮素是三者中主要的黄酮醇类物质，含量最高，但在胁迫过程中变化幅度最大的是山奈酚含量。荧光实时定量分析AhFLSs的表达情况，AhFLS2、AhFLS4和AhFLS6的表达量高，处理24h内波动幅度也高于AhFLS3和AhFLS5，3成员对胁迫的响应具有胁迫种类差异。
　　7.测定秦皇岛光秧、印度窄叶、平度中粒、盐山乌鸦窝、冀花16号、花育22号、PI497318、PI482120、PI292950的杨梅黄酮、槲皮素、山奈酚等三种黄酮醇含量，槲皮素是花生种子内主要的黄酮醇物质，山奈酚含量最低，3种黄酮醇总含量在113.19-233.225μg/g FW之间;荧光实时定量分析AhFLS2、AhFLS3、AhFLS4、AhFLS5、AhFLS6在各品种种子中的表达情况，AhFLS2和AhFLS6在9个花生品种中的表达量高于其它3个AhFLSs，且有品种差异性，在冀花16号和秦皇岛光秧中，AhFLS2比AhFLS6表达量高，在其它7个品种中均是AhFLS6的表达水平最高。
　　本研究结果可为高黄酮花生种质的合理利用和高品质花生品种的选育奠定基础，并为花生黄酮生物合成途径研究提供依据。

目录

声明

摘要

英文缩略词

第一章 引言

1 花生资源研究概况

1．1 花生种质的收集和整理

1．2 核心种质的创建

1．3 花生种质的研究及利用

2 黄酮类化合物的研究概况

2．2 黄酮类化合物的生物活性

2．3 黄酮生物合成途径

2．4 黄酮醇合成酶(FLS)研究概况

2．5 环境对植物中黄酮含量的影响

3 花生黄酮研究进展

4 本论文研究的目的意义和主要内容

第二章 花生种质资源中总黄酮含量鉴定及EST-SSR关联标记分析

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 花生种子中总黄酮含量

2．2 参试花生种质综合性状表现

2．3 黄酮含量与植株性状、产量性状以及主要品质性状的相关性分析

2．4 与花生黄酮关联的EST-SSR标记分析

3 讨论

4 小结

第三章 花生FLS基因家族克隆与序列分析

1 材料和方法

1．1 植物材料和菌株

1．2 主要试剂和药品

1．3 花生RNA提取

1．4 第一链cDNA制备

1．5 花生黄酮醇合成酶基因FLS的克隆

1．6 RACE克隆花生FLS基因

1．7 序列分析

2 结果与分析

2．1 花生总RNA提取结果

2．2 花生FLSs克隆结果

2．3 AhFLSs序列分析

2．4 AhFLSs蛋白质性质及结构分析

3 讨论

4 小结

第四章 与花生种子黄酮醇含量相关的AhFLSs表达分析

1 材料和方法

1．1 植物材料

1．2 HPLC测定黄酮醇含量

1．3 AhFLSs实时定量

2 结果与分析

2．1 各发育时期的花生种子特征

2．2 黄酮醇含量HPLC测定结果

2．3 荧光实时定量分析AhFLSs的转录水平

3 讨论

4 小结

全文结论

参考文献

攻读博士期间发表文章

作者简历

在读期间参与课题

致谢