牛Dlk1-Dio3印记区域内6个长非编码RNA的分析

摘要

基因组印记是一种表观遗传现象，是指基因组中的部分基因能够以依赖亲本来源的方式实现单等位基因表达。印记基因通常成簇存在，并且在物种间相对保守。Dlk1-Dio3印记域在细胞分化和胚胎发育过程中发挥着重要作用，该区域内印记长非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的表达与诱导全功能干细胞的发育潜能有关。
　　长非编码RNA是指长度大于200bp的一类非编码蛋白的RNA，因其在基因组中的含量巨大及具有重要的生物学功能而引起了学术界的广泛关注。根据长非编码RNA在基因组中的位置，可以将其分为反义lncRNA，基因间lncRNA，增强子lncRNA和内元lncRNA。最近，在小鼠的Dlk1-Dio3印记域内发现了一些位于基因间和基因内元的lncRNA，然而牛Dlk1-Dio3印记区域内的lncRNA研究还很少。
　　为了鉴别牛Dlk1-Dio3印记区域内的长非编码RNA，本研究选取位于Meg8基因内元上及Meg8与Meg9基因间的4组EST序列，经RT-PCR扩增，得到3个内元lncRNA和1个基因间lncRNA，分别命名为Meg8-IT1，Meg8-IT2，Meg8-IT3和Linc24062。分析这4个lncRNA基因在成年牛8个组织（心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、皮下脂肪和大脑）中的表达，发现其在被检测的组织中均表达。利用基于SNP的PCR产物直接测序法，发现Meg8-IT1，Meg8-IT2，Meg8-IT3和Linc24062在牛被检测组织中均为单等位基因表达，说明它们在牛中是印记的。
　　Mico1和Mico1os基因是在鼠Dlk1-Dio3印记域内被发现的两个母源表达的印记lncRNA。在此研究中，首先用RT-PCR的方法获得牛Mico1和Mico1os基因的cDNA序列，并通过链特异性RT-PCR确定两个基因的转录方向，证明两者是来自同一区段的双向转录物。检测Mico1和Mico1os基因在来自围产期死亡的体细胞核移植牛和自然繁殖牛的组织中的表达情况，发现在自然繁殖牛6个被检测的组织（心、肝、脾、肺、肾和大脑）中，Mico1和Mico1os基因均呈现单等位基因表达，而在体细胞核移植牛组织中发现多种异常的表达模式。为揭示DNA甲基化是否调控Mico1和Mico1os基因的单等位基因表达，针对Mico1和Mico1os基因正常和异常表达的组织，选取Mico1和Mico1os基因内部和上游的6个区域进行甲基化分析。结果显示在自然繁殖牛和体细胞核移植牛的组织中，被检测的6个区段均呈现高甲基化状态，推测DNA甲基化修饰可能未参与调控Mico1和Mico1os基因的单等位表达。在Mico1和Mico1os基因异常表达的体细胞核移植牛组织中，3个下游已知的印记基因（Gtl2，Meg9和Dio3）均呈现正常单等位基因表达，表明Mico1和Mico1os基因紊乱并未影响Dlk1-Dio3印记域内下游基因Gtl2，Meg9和Dio3的印记表达。

目录

声明

摘要

1．1．1 体细胞核移植技术

1．1．2 体细胞核移植目前存在的问题及研究现状

1．1．3 体细胞核移植过程中发生的核重编程

1．2 基因组印记的概述

1．2．1 基因组印记的定义及其发现

1．2．2 印记基因的特征

1．2．3 调控印记的表观遗传修饰——DNA甲基化及其检测方法

1．2．4 鉴定印记基因的方法

1．3 印记中的长非编码RNA

1．3．1 长非编码RNA的概述

1．3．2 不同类型的lncRNA在印记调控中的作用

1．4 Dlk1-Dio3印记域内长非编码RNA的研究现状

1．4．3 Dlk1-Dio3印记域内的基因间长非编码RNA

1．5 研究内容及意义

2．1．1 牛组织材料的获取

2．1．2 主要实验试剂及试剂盒

2．1．3 实验所用主要试剂的配制方法

2．1．4 生物信息学分析软件及网站

2．2 实验方法

2．2．1 Trizol法提取牛组织总RNA及RNA的纯化

2．2．2 反转录合成cDNA

2．2．3 牛肝脏组织DNA的提取

2．2．4 Meg8-IT1，Meg8-IT2，Meg8-IT3和Linc24062候选基因cDNA的克隆

2．2．5 牛Meg8-IT1，Meg8-IT2，Meg8-IT3和Linc24062基因杂合子个体的筛选

2．2．6 牛Meg8-IT1，Meg8-IT2，Meg8-IT3和Linc24062基因的组织表达

2．2．9 牛Mico1和Mico1os基因印记状态分析

2．2．10 Dlk1-Dio3印记域内关联基因的印记状态分析

2．2．11 牛Mico1和Mico1os基因的甲基化状态分析

3 结果与分析

3．1 提取牛总RNA的检测结果

3．2 提取牛肝脏组织基因组的检测结果

3．3 牛Meg8-IT1，Meg8-IT2，Meg8-IT3和Linc24062序列拼接，组织表达及印记状态分析

3．3．2 牛Meg8-IT1，Meg8-IT2，Meg8-IT3和Linc24062中SNP的鉴定

3．3．4 Meg8-IT1，Meg8-IT2，Meg8-IT3和Linc24062的印记状态分析

3．4 牛Mico1和Mico1os基因

3．4．2 Mico1和Mico1os在自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的表达及印记状态分析

3．5 Dlk1-Dio3印记区域内印记基因的表达及印记状态分析

3．5．1 印记基因SNP的鉴定

3．5．3 Gtl2，Meg9和Dio3在体细胞核移植牛中的印记状态分析

3．6 牛Mico1和Mico1os等位基因特异的甲基化状态分析

3．6．2 牛Mico1和Mico1os基因候选甲基化调控区域的确定

3．6．3 候选甲基化调控区域的巢式PCR扩增结果

3．6．4 6个候选调控区域的甲基化状态分析

4 讨论

4．3 Mico1和Mico1os基因cDNA序列

4．5 Dlk1-Dio3印记域内关联基因的表达及印记状态

5 结论

参考文献

在读期间发表论文

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致谢