枣MADS-box基因家族的全基因组鉴定与功能分析

摘要

枣树（Ziziphus jujuba Mill.）作为一种药食两用的经济林树种，在我国被广泛种植。与苹果、梨等果树相比，枣树具有独特的开花特性，比如童期短，当年即可开花结果;成龄树的花芽分化与结果枝生长同时进行，在一个生长季内即可完成花芽分化到果实成熟的全过程，不存在花芽休眠的现象。前人研究表明，MADS-box家族基因是调控植物花器官发育的关键基因，而目前对枣MADS-box家族基因的研究还很少。2014年，我们完成了枣的全基因组测序，为在基因组水平开展MADS-box基因家族在枣花果发育中的作用研究提供了可能。因此，本研究首先利用HMM、GSDS2.0、MEGA5.1和MEME等生物信息学软件在基因组范围内对枣MADS-box家族基因进行鉴定及分类，然后利用RT-PCR、qRT-PCR等技术研究该家族基因在不同枣品种的花及果实发育过程中的表达模式，最后将筛选出的部分基因进行转基因功能验证，为深入阐明MADS-box基因在枣花器官发育中的相关功能提供了线索和参考。本研究的主要结果如下:
　　1.在枣基因组中鉴定出52个MADS-box基因，其中包括24个Ⅰ型基因，28个Ⅱ型基因。Ⅰ型基因分为3个亚家族:Mα、Mβ和Mγ亚家族，分别包含16、5、3个基因。Ⅱ型基因又分为MIKC*和MIKCC亚家族，分别包含3和25个基因。枣MIKCC型基因分为13个亚家族，与拟南芥相比，增加了TM8亚家族，与梅花相比，增加了FLC亚家族。
　　2.基于生物信息学分析，将37个MADS-box基因定位在枣12条假染色体上，12个基因位于scaffold上;另外，同源克隆获得的3个基因没有定位到染色体或scaffold上。TypeⅠ中的14个基因位于7条染色体上，1号染色体上分布的基因数目最多;TypeⅡ中的23个基因在9条染色体中不均匀分布，基因分布数目较多的是6、8、10、12号染色体。此外，scaffold1156、1、10号染色体上存在成簇的MADS-box基因，为串联重复基因。
　　3.组织特异性表达分析结果表明，枣MADS-box基因主要在花、果等生殖器官表达，发现MIKC类与花发育密切相关，通过该类基因在不同枣品种的花及胚发育中的时空表达模式分析，表明ABCDE类基因在枣花的4轮花器官发育中呈现规律的时序表达模式，分别在花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊中顺序表达。而SOC1和SVP类基因主要在营养器官中高丰度表达，CO等调控基因主要在花发育前期表达量较高。
　　4.通过同源克隆获得6个Ⅱ型MADS-box基因，其中2个A类基因、1个D类基因、3个E类基因。其氨基酸序列与其他植物同源基因的相似性为79％以上，都含有一段MADS结构域的高度保守序列，编码约50-60个氨基酸。
　　5.在拟南芥中过表达枣E类SEP3亚家族基因（ZjMADS47），发现转基因植株具有提前开花和将花序分生组织转变为花分生组织的功能，使拟南芥提前进入生殖生长阶段，转基因植株前期叶片卷曲、变窄、颜色加深，后期叶片发黄，长角果变短，种子数目减少。进一步证明了枣E类基因具有调控植物花和种子发育的功能。
　　综上，本研究在系统研究枣MADS-box基因家族的基础上，分析了与花器官发育密切相关基因在枣花及果实（胚）发育中的时空表达模式，还对重点基因进行了转基因功能验证。从分子水平证明了该类基因在枣花及果实发育中具有重要作用，为进一步揭示枣树独特的开花机制提供了线索和依据。

目录

声明

摘要

缩略词索引表

1．1．1 枣树栽培历史

1．1．2 枣树开花结果习性

1．2．1 植物MADS-box基因结构和分类

1．2．2 植物MADS-box基因的功能

1．3 枣MADS-box基因的研究进展

1．4 本研究的目的意义

2．1．1 数据库资源

2．1．2 克隆基因所用材料

2．1．3 花发育相关基因筛选及表达模式分析所用材料

2．1．4 转基因功能验证所用材料

2．2 主要试剂

2．3 培养基和营养液配制

2．3．1 培养基

2．3．2 拟南芥培养所用营养液

2．4 主要仪器

2．5 试验方法

2．5．2 枣MIKC类MADS-box基因克隆

2．5．3 枣MIKC类MADS-box基因表达模式分析

2．5．4 枣D类和E类基因导入拟南芥的功能分析

3 结果与分析

3．1．1 枣基因组MADS-box基因鉴定及序列分析

3．1．2 枣MADS-box基因系统进化分析

3．1．3 枣MADS-box基因结构分析

3．1．4 枣MADS-box基因染色体定位及复制方式分析

3．1．5 枣MADS-box基因的组织特异性表达分析

3．2 MIKC类MADS-box基因的表达模式分析

3．2．2 MIKC类MADS-box基因在不同花器官的表达

3．2．3 MIKC类MADS-box基因在花不同发育时期的表达

3．2．4 MIKC类MADS-box基因在幼果不同发育时期的表达

3．2．5 MIKC类MADS-box基因在枣树花变叶中的表达

3．3．1 总RNA的提取和检测

3．3．2 MIKC类基因的克隆

3．4 枣D类和E类基因导入拟南芥的功能分析

3．4．1 ZjSEP3-OE和ZjAG-OE转基因植株的获得

3．4．2 ZjSEP3-OE拟南芥转基因植株的表型观察

4 讨论

4．2 枣花发育相关MADS-box基因的时空表达模式分析

4．3 枣ZjSEP3基因在花和种子发育中的功能

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢