光肩星天牛嗅觉感受相关基因AglaOBP和AglaTSP克隆及生物信息学分析

摘要

为了探索光肩星天牛的化学信号感受机制，对光肩星天牛的生态防控提供新的策略和作用靶点，本研究利用SMART技术构建了其触角全长cDNA文库，筛选克隆得到两个新的嗅觉相关基因(AglaOBP和AglaTSP)cDNA序列全长，并采用生物信息学软件对其进行氨基酸序列分析以及蛋白质结构与功能预测;利用荧光原位杂交技术研究了AglaOBP和AglaTSP基因的组织定位，通过实时荧光定量明确了这两个基因的时空和组织表达特异性，主要研究结果如下:
　　(1)构建了光肩星天牛触角全长cDNA文库，文库滴度为1.5×109pfu/mL，库容量为1.35× 106 pfu/mL，重组率95％，完整性比率为68.6％。
　　(2)利用RACE技术成功克隆了光肩星天牛嗅觉感受相关基因AglaOBP和AglaTSP。AglaOBP开放阅读框架长度为435bp，编码144个氨基酸，基因登录号为KY039580; AglaTSP开放阅读框架长度为702bp，编码233个氨基酸，基因登录号AKM70275.1.
　　(3)氨基酸序列分析AglaOBP含有21个信号肽序列，4个保守半胱氨酸，保守结构域分析表明光肩星天牛气味结合蛋白AglaOBP属于OBPs家族，因此AglaOBP属于OBPs家族中的Minus-C OBP家族。三级结构预测表明AglaOBP有8个配体结合位点。通过ExPASy分析AglaOBP的理化性质，得出其相对分子量为14102.32，理论等电点为4.92，亲水性平均系数为-0.064，为亲水性蛋白。氨基酸序列分析AglaTSP含有22个信号肽序列，保守结构域分析表明光肩星天牛四跨膜蛋白AglaTSP属于Tetraspanin超家族，含有4个跨膜区，并且含有最大胞外环LEL（氨基酸序列9-221），最大胞外环内含有GCC结构、CG结构、GC结构和PLSC结构。三级结构预测表明AglaTSP含有3个配体结合位点。通过ExPASy分析AglaTSP的理化性质，得出其相对分子质量为15250.02，理论等电点为5.24，不稳定系数是17.29，为稳定的蛋白，亲水性平均系数为0.722，说明该蛋白为疏水蛋白。
　　(4)利用荧光原位杂交技术研究光肩星天牛嗅觉感受相关基因AglaOBP和AglaTSP在雌雄成虫不同组织中的表达位置，结果显示，AglaOBP基因在触角中表达位置广泛，在足、鞘翅和膜翅中主要表达于边缘部位;AglaTSP基因主要分布在膜翅边缘部位。
　　(5)根据克隆得到的AglaOBP和AglaTSP基因序列，设计特异性引物，以18SrRNA为内参基因，利用RT-qPCR技术检测AglaOBP和AglaTSP基因在不同组织（触角、鞘翅、膜翅、鄂唇须、前足、中足和后足）、不同性别和不同虫态的时空表达情况。结果显示，在成虫期不同组织中，AglaOBP基因表达存在差异，在鞘翅中雌雄的相对表达量均最高，其后依次为中足、前足和膜翅，差异达到极显著水平;但雄虫膜翅的相对表达量低于前足，差异达到极显著水平;雌虫膜翅的相对表达量高于前足，但没有明显差异;剩余其他组织低于或等于对照。在不同性别中，AglaOBP基因表达存在差异，雄虫中鞘翅、中足的相对表达量极显著高于雌虫;雄虫前足显著高于雌虫前足;其他组织中雌雄的相对表达量没有明显差异。不同虫态中，AglaOBP基因在卵、幼虫期头部、去除头部的剩余组织与成虫触角中表达水平无显著性差异。AglaTSP基因在光肩星天牛成虫期不同组织和性别的表达中，膜翅中的相对表达量极显著高于其他组织，雌虫的相对表达量极显著高于雄虫。不同虫态的表达中，卵、幼虫期头部、幼虫期去除头部的剩余组织与成虫期触角中的表达水平无明显差异。

目录

声明

摘要

1．1 研究背景和意义

1．2 国内外研究现状

1．2．1 昆虫嗅觉机制研究进展

1．2．2 光肩星天牛的寄主定位机制研究

1．2．3 昆虫嗅觉相关蛋白研究进展

1．3 亟待解决的问题与展望

1．4 研究目标、研究内容与技术路线

1．4．1 研究目标

1．4．2 研究内容

1．4．3 技术路线

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 研究方法

2．2．1 光肩星天牛触角全长cDNA文库的构建

2．2．2 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP基因的克隆

2．2．3 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP的序列分析

2．2．4 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP基因的组织定位

2．2．5 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP基因的时空表达

3 结果与分析

3．1 光肩星天触角全长cDNA文库的构建

3．1．1 光肩星天牛触角总RNA的质量检测

3．1．2 cDNA第一链和第二链合成

3．1．3 光肩星天牛触角cDNA文库质量评价

3．1．4 cDNA质粒文库的序列分析

3．2 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP基因全长的获得及序列分析

3．2．1 光肩星天牛触角总RNA质量检测

3．2．2 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP基因全长的获得

3．2．3 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP序列分析

3．2．4 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP二级和三级结构预测

3．3 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP基因的组织定位

3．4 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP基因的时空表达

3．4．1 引物特异性和扩增效率检测

3．4．2 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP基因的组织特异性表达

3．4．3 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP基因的时空表达

4 讨论

4．1 光肩星天牛触角全长cDNA文库的构建

4．2 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP全长基因的获得及序列分析

4．3 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP基因的组织定位

4．4 光肩星天牛AglaOBP和AglaTSP基因的时空表达

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢