GmVP1基因克隆与转化及GmVP1/GmNHX1双价基因大豆发状根的耐盐性分析

摘要

大豆[Glycine max(L.)Merrill]是我国重要的粮食作物和油料作物，富含植物蛋白已成为人们日常食用和对外出口的主要农作物。然而由于土壤盐碱化的加重，严重影响了我国大豆的推广与生产。利用基因工程技术将抗逆基因转入优质大豆品种，培育抗盐、高产大豆新品种成为解决这一问题的有效途径。植物的抗盐性状是由多基因协同调控、共同表达的结果，进行多基因转化提高植物抗盐性是目前基因工程的一个重要挑战，也是今后培育抗逆品种的重要发展方向。Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)是一类重要的离子转运蛋白，在不同植物响应盐胁迫的过程中发挥重要功能，本实验室前期已证实过表达GmNHX1能提高拟南芥耐盐性并且能够恢复酵母突变体的耐盐性。另外，已有研究表明液泡膜H+-焦磷酸酶基因（VP）的表达可增加H+跨膜驱动力，从而有利于离子转运蛋白转运有害离子。因此，本研究从抗盐大豆品种冀豆7号中克隆了液泡膜H+-焦磷酸酶基因GmVP1，构建了GmVP1单价以及GmVP1与GmNHX1双价转化载体，利用发根农杆菌介导的大豆子叶转化体系单独表达GmVP1或GmVP1与GmNHX1共表达，并初步分析单价和双价基因的抗盐能力，为培育多基因转化的大豆抗盐新品种奠定基础。主要结果如下: 1.利用同源克隆技术从冀豆7号中克隆得到大豆液泡膜H+-焦磷酸酶基因GmVP1，该基因CDS全长为2307 bp，编码768个氨基酸。 2.生物信息学分析表明，GmVP1基因编码蛋白为疏水性跨膜蛋白，与烟草(Nicotiana tabacum)的液泡膜H+-焦磷酸酶基因蛋白同源性最高;GmVP1蛋白定位于液泡膜，有13个跨膜结构域，预测其具有增加H+跨膜驱动力的功能。 3.利用RT-qPCR检测了盐胁迫处理条件下大豆GmVP1基因的转录水平。经不同浓度NaCl处理12h，发现在抗盐品种中GmVP1的表达量在35-140 mM NaCl浓度下呈现较高水平表达，而在盐敏感品种中GmVP1的表达量随NaCl浓度的升高呈下降的趋势。初步证明GmVP1在转录水平响应盐胁迫，可能在大豆抵御盐胁迫过程中发挥重要作用。 4.构建了pCAMBIA3301-GmVP1植物双元表达载体，通过发根农杆菌介导法转化大豆品种五2星号子叶，获得了转GmVP1的大豆发状根。在70 mM NaCl处理条件下，转GmVP1基因的大豆发状根平均最大根长明显高于转空载体的对照，差异显著，且平均发根数较对照多，但差异不显著;150 mM NaCl处理条件下，转GmVP1基因的发状根以及转入空载体的对照均明显受到抑制，平均最大根长和平均发根数与对照无差异。初步证明GmVP1基因在一定条件下可以提高转基因大豆发状根对NaCl的耐受性。 5.构建了pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1植物双价基因表达载体，利用发根农杆菌介导法转化五星2号子叶，获得了转GmVP1/GmNHX1双价基因的大豆发状根。经70、150 mM NaCl处理后，转GmVP1/GmNHX1双价基因的大豆发状根的平均最大根长均明显大于转GmVP1基因以及空载体对照的发状根，呈显著性差异;70 mM NaCl处理时平均发根数多于与转GmVP1基因以及对照，差异显著;而150 mM NaCl处理时平均发根数与转GmVP1基因以及对照无差异。初步证明GmVP1/GmNHX1双价基因过表达比GmVP1单基因过表达更能提高大豆发状根相对生长量及其耐盐性。 6.测定了不同盐胁迫处理条件下转GmVP1基因以及GmVP1/GmNHX1双价基因发状根中POD和SOD酶活力以及MDA含量。转GmVP1基因发状根的POD和SOD的酶活性在70 mM NaCl浓度下均高于转空载体对照，MDA含量低于对照;而转GmVP1/GmNHX1双价基因发状根的POD、SOD酶活性在70、150 mM NaCl浓度下均高于转Gm VP1单价基因的发状根及对照，70 mM NaCl浓度下转GmVP1/GmNHX1双价基因发状根的MDA含量低于对照但高于转GmVP1，150 mM NaCl浓度下低于转GmVP1和对照。进一步说明与单独转化GmVP1基因相比转化GmVP1/GmNHX1双价基因能够更有效地降低盐胁迫对细胞造成的伤害，并增强大豆发状根抵御盐胁迫的能力。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．1盐胁迫对大豆的危害

1．2植物耐盐基因研究现状

1．2．1 Na+／H+逆向转运蛋白

1．2．2H+-焦磷酸酶

1．3双价基因遗传转化研究现状

1．4发根农杆菌转化体系在基因功能分析中的应用

2材料与方法

2．2．2主要试剂耗材

2．3试验涉及的培养基配置

2．4试验涉及的引物

2．5 GmVP1基因克隆及生物信息学分析

2．5．1供试大豆培养

2．5．2植物总RNA的提取与检测

2．5．3 cDNA第一链的合成

2．5．4利用PCR技术扩增GmVP1基因

2．5．5GmVP1基因生物信息学分析

2．6盐胁迫下GmVP1在转录水平的表达分析

2．6．1供试大豆的培养、处理和取样

2．6．2植物总RNA提取和检测

2．6．3 sscDNA的合成

2．6．4实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测基因表达量

2．7．2K599农杆菌感受态的制备

2．8．2K599农杆菌感受态的制备

2．10转基因发状根的鉴定及其耐盐性分析

2．10．1大豆发状根的PCR检测

2．10．4大豆发状根的POD酶活性测定

2，10．5大豆发状根的SOD酶活性测定

2．10．6大豆发状根的MDA含量测定

3结果与分析

3．2GmVP1生物信息学分析

3．2．2 GmVP1序列同源分析

3．2．3GmVP1的疏水性分析

3．2．4 GmVP1的二级结构预测

3．2．5 GmVP1的三级结构预测

3．4 pCAMBIA3301-GmVP1植物表达载体的构建

3．5转GmVP1基因大豆发状根的鉴定

3．6转GmVP1基因大豆发状根的耐盐性检测

3．7pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1双价耐盐基因植物表达载体的构建

3．8转GmVP/GmNHX1基因大豆发状根的鉴定

3．9转GmVP/GmNHX1基因大豆发状根的耐盐性检测

3．10转GmVP、GmVP/GmNHX1基因大豆发状根的生理指标检测

3．10．2转GmVP、GmVP/GmNHX1基因大豆发状根的SOD活性测定

3．10．3转GmVP、GmVP/GmNHX1基因大豆发状根的MDA含量测定

4讨论

4．1VP基因在植物抵御盐胁迫过程中的作用

4．2双价基因转化在植物耐盐中的应用

4．3下一步研究展望

5结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢