鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析

摘要

“鸭短喙-侏儒综合征”(Beak atrophy and dwarfism syndrome，BADS)是一种以雏鸭发育不良、喙萎缩变形、舌外伸肿胀和骨质疏松为主要特征的传染病。自2014年11月以来，该病在我国东南多省的商品肉鸭群中发生并流行，给我国鸭养殖业造成了严重的经济损失。本研究旨在从流行病学与病原学角度出发，分离相关病原进行致病性分析，明确引发BADS的病因，并建立病原实验室检测方法，探究致病病原的相关特性，为该病的防控提供理论依据及技术支持。本文主要从以下三个方面进行论述:
　　首先，为了探究BADS的致病原因，本研究对发生BADS病鸭的肝脏和脾脏进行了PCR/RT-PCR检测，排除了其他的鸭常见疫病，将该病的病原命名为鸭细小病毒(Duck parvovirus，DPV)。将阳性病料研磨液接种鸭胚，盲传5代，收获尿囊液，通过PCR检测、测序鉴定、同源进化分析、动物回归试验，最终确定本研究成功分离到了一株DPV（命名为DPV SD）。此外，本研究还利用鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblasts，DEF)对病毒进行了分离培养，PCR和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)结果表明，本研究成功获得了SD株的细胞分离毒。DPV SD株的成功分离为DPV的进一步研究打下了基础。
　　其次，为了进一步探究DPV分子水平上的特性，本研究对SD株的全基因组序列进行了分段扩增，并对其基因序列进行了结构特征分析及同源进化分析。结果表明，SD株全长5053bp，由两端的末端倒置重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)和中间的开放阅读框（Open reading frame，ORF）组成。左侧ORF(LORF)编码非结构蛋白NS，右侧ORF(RORF)编码结构蛋白VP。SD株与其他BADS分离株和鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)欧洲分离株的亲缘关系较近，而与番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)分离株的关系较远。此外，与绝大多数水禽细小病毒相比，SD株的ITR区分别于100～114nt和337～350nt的区域存在14个碱基的缺失。最后，潜在糖基化位点的预测分析结果表明，SD株NS和VP蛋白上共有6个潜在糖基化位点。本研究为DPV的分子致病机制及分子流行病学调查的深入研究奠定了基础。
　　最后，本研究通过PCR扩增了SD株的VP3基因，构建了标准品重组质粒pMD19-SD-VP3。选取VP3基因中在各株DPV之间较为保守且和其他水禽细小病毒有差异的区域，设计了1对荧光定量PCR引物及1条荧光探针。经过对反应体系的优化和标准曲线的绘制，最终建立了针对DPV的荧光定量PCR检测方法，并对其特异性、灵敏性和可重复性进行了验证。结果表明，建立的DPV Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、可重复性良好。此检测方法的建立为DPV的实验室诊断提供了有力的技术支持。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 水禽细小病毒病原学研究进展

1．1．1 分类地位

1．1．2 形态特征及理化特性

1．1．3 宿主范围及培养特性

1．1．4 分子生物学特征

1．2 水禽细小病毒流行病学研究进展

1．2．1 主要临床症状及病理变化

1．2．2 诊断方法

1．2．3 防制

1．3 研究目的及意义

2．1 材料

2．1．1 病毒、临床样品和实验动物

2．1．2 主要分子生物学试剂和常用生化试剂

2．1．3 细胞培养溶液

2．1．4 工程菌培养及质粒转化用溶液

2．1．5 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 病原的PCR检测及纯净性检测

2．2．2 SD株鸭胚毒的分离与鉴定

2．2．3 动物回归试验

2．2．4 SD株细胞毒的分离与鉴定

2．2．5 SD株全基因组各片段重组质粒的构建

2．2．6 SD株全基因组序列的拼接及分析

2．2．7 荧光定量PCR引物及探针的设计

2．2．8 PCR反应体系的优化及标准曲线的绘制

2．2．9 荧光定量PCR检测方法的验证

3 结果与分析

3．1 DPV SD株的分离与鉴定

3．1．1 发病鸭的流行病学及临床特征

3．1．2 病原PCR检测及纯净性检测结果

3．1．3 鸭胚分离毒PCR鉴定结果

3．1．4 EID50测定结果

3．1．5 动物回归试验结果

3．1．6 细胞分离毒PCR鉴定结果

3．1．7 细胞分离毒IFA检测结果

3．2 DPV SD株全基因组序列的测定与分析

3．2．1 各片段PCR电泳结果

3．2．2 全基因组序列特征分析

3．2．3 NS基因序列特征分析

3．2．4 VP基因序列特征分析

3．2．5 ITR区序列特征分析

3．2．6 潜在糖基化位点预测分析

3．3．1 Taq-Man实时荧光定量PCR引物的验证

3．3．2 标准品的制备

3．3．3 反应体系的优化结果

3．3．4 标准曲线的绘制

3．3．5 特异性试验结果

3．3．6 敏感性试验结果

3．3．7 重复性试验结果

3．3．8 临床样品检测结果

4．1 DPV SD株的分离与鉴定

4．2 DPV SD株基因组全序的测定与分析

4．3 DPV Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法的建立

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢