奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及β-防御素4和5对其抑菌活性研究

摘要

奶牛乳房炎给奶牛养殖业造成巨大的经济损失，其致病因素包括化学、物理和微生物等，主要病原菌有金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠埃希菌等，目前尚未发现高效的防治方法。β-防御素(β-defensins)是一种阳离子抗菌肽，不仅免疫调节功能，而且可以通过破坏细菌细胞膜结构而具有抗菌功能，且不易产生抗药性。牛β-防御素4和5（mature bovine neutrophilβ-defensin4and5，mBNBD4，mBNBD5）在体内参与炎症反应的成熟肽。为此，本研究从河北省患乳房炎奶牛的奶样品中分离了病原菌;并对己构建好的mBNBD4-pPIC9K和mBN-BD5-pPIC9K毕赤酵母菌株，进行β-防御素的诱导表达和纯化;进一步利用纯化后的mBNBD4、mBNBD5体外作用于所分离的乳房炎病原菌，观察其体外抗菌效果。旨在为河北奶牛乳房炎致病菌进行流行病学调查并为mBNBD4、mBNBD5的应用提供理论依据。
　　奶牛乳房炎致病菌的分离鉴定应用微生物学以及分子生物学方法，从河北地区采集159份患乳房炎的病牛乳样，进行细菌分离培养，并进行形态学、生化及PCR鉴定。结果分离出三类主要致病菌，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠埃希菌共96株。其中无乳链球菌56株，占总分离菌株数的58.3％，且有50株是β-溶血型，占无乳链球菌总数的89.3％，是致病性菌株，α-溶血型6株，占无乳链球菌总数的10.7％;其次是金黄色葡萄球菌共23株，占总分离菌株数的24.0％;大肠杆菌共17株，占总分离菌株数的17.7％。
　　β-防御素的抑菌性检测对已构建好的mBNBD4-pPIC9K和mBNBD5-pPIC9K毕赤酵母菌株，进行重组蛋白的诱导、表达和纯化，并检测重组蛋白mBNBD4和mBNBD5的抗菌生物活性，本研究将上述分离到的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌分别与3种不同浓度的2种重组蛋白在琼脂板上共培养，重组蛋白的浓度分别为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL，对菌落形成单位进行CFU平板计数法统计，结果发现20μg/mL的mBNBD4与20μg/mL的mBNBD5两种β-防御素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑菌活性，且抑菌活性在所试范围内与浓度呈正相关。而且从抑菌效果看，重组蛋白mBNBD4和mBNBD5对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于大肠杆菌。本研究为防御素的对奶牛乳房炎的防治奠定了理论基础。

目录

声明

摘要

1引言

1．1奶牛乳房炎概述

1．2奶牛乳房炎的类型和临床症状

1．2．1隐性乳房炎

1．2．2临床型乳房炎

1．3奶牛乳房炎的发生机理

1．3．1病原菌入侵乳房

1．3．2病原菌对乳腺上皮细胞的黏附和侵入

1．3．3病原菌对乳房的感染和影响

1．3．4乳房组织对病原菌感染的炎症反应

1．4奶牛乳房炎的发病原因

1．4．1微生物感染

1．4．2奶牛个体对乳房炎的影响

1．4．3季节与气候变化

1．4．4饲养管理

1．4．5奶牛干奶期的影响

1．5奶牛乳房炎的诊断方法

1．5．1微生物检测法

1．5．2 LMT诊断法

1．5．3乳汁中体细胞计数

1．5．4 PCR诊断

1．6奶牛乳房炎的治疗

1．6．1临床型乳房炎

1．6．2隐性乳房炎

1．7奶牛乳房炎的预防

1．7．1搞好环境卫生

1．7．2加强奶牛干奶期的管理

1．7．3 DHI监测以及疫苗免疫

1．8防御素

1．8．1防御素的分类和结构特点

1．8．2防御素在宿主免疫防御中的功能

1．9防御素的应用前景

1．9．1替代抗生素

1．9．2治疗肿瘤性疾病

1．9．3替代防腐剂

1．10研究目的与意义

2．1．1试验牛乳

2．1．2表达菌株

2．1．3试验主要仪器

2．1．4试验药物及试剂

2．2试验方法

2．2．1病原菌的分离培养与鉴定

2．2．2病原菌的鉴定：镜检、生化及PCR

2．2．3重组蛋白的诱导表达及条件筛选

2．2．4重组蛋白的纯化与透析

2．2．5重组蛋白的鉴定

2．2．6重组蛋白的抑菌实验方法

3试验结果

3．1乳房炎病原菌培养的结果

3．1．1培养特性

3．1．2染色特性

3．1．3生化鉴定结果

3．1．4 PCR鉴定结果

3．2 β-防御素4和和5在毕赤酵母菌株中的诱导表达

3．2．1诱导条件的筛选

3．2．2诱导表达结果

3．2．3表达蛋白的鉴定

3．3 β-防御素4和5重组蛋白的抑菌活性检测

4．1细菌的分离鉴定

4．2重组蛋白的表达纯化

4．3重组蛋白的抑菌作用

5结论

参考文献

作者简介

致谢