苹果响应轮纹病菌侵染的转录组分析及抗性相关基因的克隆

摘要

苹果轮纹病菌侵染苹果果实、枝干和叶片，造成苹果产量下降和品质降低，尤其在我国，主栽品种为富士，对轮纹病高感，导致苹果轮纹病的发生更为严重。本研究以苹果品种“鸡冠”和“富士”的杂交后代中选择的抗病株系“1-1-46”和感病株系“1-1-40”的叶片为试材，接种轮纹病菌（Bberengeriana f.sp.Piricola），进行苹果响应轮纹病菌侵染的转录组分析，筛选抗病相关基因，为探究植物与病原菌互作的机制提供参考。主要结果如下:
　　1.叶片接菌后0.5d、1d、2d、3d、4d、5d和6d，抗病株系“1-1-46”叶片的病斑面积均显著小于感病株系“1-1-40”。抗、感株系的叶片接菌后3d、4d、5d和6d，病斑面积均显著大于未接菌叶片，病斑增长高峰均在接菌后4d-5d。
　　2.通过对抗、感株系接菌4d处理及对照共18个样品进行转录组测序分析，获得的总数据量为118.26Gb，423，279，382对reads;抗病株系“1-1-46”被轮纹病菌侵染后差异基因的数量为1219个（872上调、347下调），远高于感病株系“1-1-40”68个（50上调、18下调）。且上调表达的差异基因数量明显多于下调表达的差异基因数;对抗病株系特有的226个差异基因进行分析，在抗病相关通路中，富集于植物激素信号转导的有7个基因，分别为MD06G1046300(SnRK2，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SnRK2)、MD07G1203700(PP2C，蛋白磷酸酶2C)、MD02G1084600(PP2C)、MD01G1220800(PP2C)、MD15G1195800(PP2C)、MD01G1158500(PYL，脱落酸受体PYR/PYL)、MD15G1081800(ABF、ABA反应元件结合因子);苯丙素生物合成有2个基因:MD01G1218900(COMT，咖啡酸/3-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶)、MD13G1257800（4CL，4-对-香豆酸CoA连接酶）;参与苯丙氨酸代谢的基因为MD13G1257800（4CL，4-对-香豆酸CoA连接酶）;参与植物病原体相互作用的基因为MD06G1231000（CML，钙结合蛋白）。通过对变化明显的20个差异基因进行q-PCR验证表明转录组测序结果可靠。
　　3.对CML、SnRK、PP2C-1、PP2C-2、PP2C-3、PP2C-4、MdCf3、MdMBP2、MdACBP2和MdCEBiP1十个响应轮纹病菌侵染的基因进行q-PCR分析，发现接种轮纹病菌后，抗病株系中的响应基因反应强烈，感病株系反应迟缓。
　　4.根据苹果基因组已知同源序列获得了苹果蛋白磷酸酶2C基因MD01G1220800和MD07G1291000的ORF区序列，并获得了克隆产物。

目录

声明

摘要

1引言

1．1 苹果轮纹病的发生及危害

1．2 苹果与轮纹病互作的分子机制

1．3 轮纹病防控技术

1．4 植物抗病性的转录组学研究

1．5 研究目的及意义

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株材料

2．1．3 试验试剂

2．1．4 试验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 叶片接种轮纹病菌

2．2．2 总RNA提取以及纯度、完整性鉴定

2．2．3 cDNA合成

2．2．4 0 d和4 d的叶片进行转录组测序

2．2．5 荧光定量PCR反应

2．2．6 蛋白磷酸酶2C基因PP2C克隆

2．3 试验引物

3．1 处理后叶片病斑的变化

3．2 轮纹病菌侵染下抗、感株系叶片转录组测序分析

3．2．2 测序结果统计

3．2．3 接种轮纹病菌后差异基因筛选

3．2．4 差异基因功能注释及分类(COG／GO)

3．2．5 KEGG分析

3．2．6 差异基因分析

3．2．7 q-PCR验证

3．3 基因表达量变化

3．3．2 轮纹病菌侵染对苹果叶片SnRK2基因表达的影响

3．3．3 轮纹病菌侵染对苹果叶片PP2C-1基因表达的影响

3．3．4 轮纹病菌侵染对苹果叶片PP2C-2基因表达的影响

3．3．5 轮纹病菌侵染对苹果叶片PP2C-3基因表达的影响

3．3．6 轮纹病菌侵染对苹果叶片PP2C-4基因表达的影响

3．3．7 轮纹病菌侵染对苹果叶片Mdcf3基因表达的影响

3．3．8 轮纹病菌侵染对苹果叶片MdMBP2基因表达的影响

3．3．9 轮纹病菌侵染对苹果叶片MdACBP2基因表达的影响

3．3．10轮纹病菌侵染对苹果叶片MdCEBiP1基因表达的影响

3．4 蛋白磷酸酶2C基因PP2C克隆

3．4．1 PCR扩增苹果PP2C基因

3．4．2 菌落PCR验证

3．4．3 PP2C基因PCR产物测序分析

3．4．4 苹果PP2C同源基因MD01G1220800氨基酸结构分析

3．4．5 苹果PP2C同源基因MD07G1291000氨基酸结构分析

4讨论

4．1 轮纹病菌侵染下抗、感株系叶片转录组测序分析

4．2 轮纹病菌侵染下抗、感株系中基因表达量变化分析

4．3 抗性相关代谢途径及基因分析

5结论

参考文献

附录

作者简介

致谢