核桃种仁脂肪酸合成基因表达分析及JrFAD3-1基因的克隆

摘要

核桃（Juglans regia L.）材质坚硬、坚果营养丰富，是重要的经济树种，广泛栽培于世界各地。核桃仁的主要成分是脂肪酸，其中含有大量的不饱和脂肪酸，如亚油酸、亚麻酸，均是人类的必需脂肪酸，对人体生长发育和健康具有重要的作用。深入研究核桃脂肪酸形成的分子机制，特别是解析不饱和脂肪酸的形成机制，将为实现不饱和脂肪酸合成调控奠定理论基础，并为创建新种质提供技术和方法。本试验采用转录组测序技术分析了核桃种仁不同发育时期脂肪酸合成基因表达情况，通过生物信息分析挖掘到FAD基因家族成员，对其组织表达特性进行研究，筛选FAD3-基1因，进一步对其进行功能和表达分析，结合种仁中α-亚麻酸含量的动态变化，确定其为催化α-亚麻酸合成的关键酶基因，并对其进行克隆和植物表达载体构建。主要研究结果如下:
　　1.应用转录组测序技术，分析了核桃花后70d、90d和110d三个不同成熟期的种仁中脂肪酸合成相关基因的表达情况。随着种仁发育进程的推进，除脂质代谢通路呈现上调表达趋势外，富集到的其余25条代谢通路均出现不同程度的下调，这一现象与种仁成熟过程中脂肪酸大量积累相吻合。进一步分析脂质代谢通路可以发现两个品种均以不饱和脂肪酸生物合成为主，其中参与α-亚麻酸合成的酶基因FAD3-1表达上调尤为突出。
　　2.通过拟南芥FAD家族蛋白序列构建隐马尔可夫模型共获得25个核桃FAD家族基因，编码30条蛋白质序列，长度均在150至455个氨基酸之间。通过系统发育分析发现FAD家族存在四个亚家族:SAD去饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase)亚家族，△7/△9去饱和酶(△7/△9desaturase)亚家族，△12/ω3去饱和酶（△12/ω3desaturase）亚家族和“前端”去饱和酶（“front-end”desaturase）亚家族。通过半定量检测发现，其中SAD去饱和酶亚家族和△7/△9去饱和酶亚家族在种仁中特异表达，“前端”去饱和酶亚家族在全部组织中均有表达。
　　3.应用实时荧光定量PCR技术对两个品种的10个不同成熟期的种仁中FAD3-1基因的表达情况进行分析，结果表明该基因在种仁发育期相对表达量变化较为剧烈，整个过程中的表达变化呈现“钟形”。在‘清香’种仁中，其相对表达量自花后70d开始缓慢升高，至花后100d表达水平达到峰值，随后降低，至花后120d时维持在较低水平。‘赞美’种仁中该基因的相对表达量变化趋势与‘清香’中相似。
　　4.以‘清香’花后100d的种仁为试材，克隆获得FAD3-1基因片段，长1134bp，与已公布的核桃FAD3基因相似性达99％以上，并以此构建了FAD3-1-NE-pRI101-AN植物表达载体。

目录

声明

摘要

缩写词目录

1．引言

1．1核桃种子发育

1．1．1核桃种子构成及形态变化

1．1．2核桃种仁发育过程中营养物质的积累

1．2植物脂肪酸概述

1．2．1植物脂肪酸的生物功能及分类

1．2．2植物脂肪酸的合成

1．2．3核桃脂肪酸

1．3 FAD(fatty acid desaturase)基因家族

1．3．1 FAD基因家族的分类及功能

1．3．2 FAD3的结构和功能

1．4选题目的意义

2．1．1植物材料

2．1．2主要试剂

2．1．3主要仪器设备

2．2总RNA提取及反转录

2．3转录组测序及数据分析

2．4基因家族分析

2．5引物设计

2．5．1转录组数据验证

2．5．2 FAD家族组织表达特异性

2．5．3 FAD3-1基因克隆

2．6．3连接克隆载体pMD 19-T

2．6．4 pRI101-AN载体骨架与插入片段的获得与链接

3 结果与分析

3．1总RNA样品的完整度与纯度

3．2转录组数据拼接及注释

3．2．1序列获得与转录本重构

3．2．2转录本序列注释

3．2．3转录本功能注释

3．3不饱和脂肪酸合成相关基因的表达

3．3．1不饱和脂肪酸合成

3．3．2糖酵解与不饱和脂肪酸合成

3．3．3实时荧光定量PCR验证

3．4核桃α-亚麻酸合成基因JrFAD3-1鉴定

3．4．1核桃基因组FAD基因家族

3．4．2 FAD家族组织表达特异性

3．4．3种仁不同发育期FAD3-1的表达变化与α-亚麻酸的积累

3．5 JrFAD3-1的克隆与植物表达载体构建

3．5．1 JrFAD3-1的克隆

3．5．2植物表达载体构建

4 讨论

4．1核桃种仁的发育与脂肪酸的积累

4．2脂肪酸合成与糖酵解

4．3 FAD基因家族

5．结论

参考文献

作者简历

致谢