大白菜叶色深绿突变体dg和抗软腐病突变体sr的鉴定及候选基因功能研究

摘要

大白菜（Brassica rapa ssp.pekinesis）原产于中国，属十字花科芸薹属（Brassica），是我国种植面积最广的蔬菜作物。植物叶色突变体通常可作为研究光合系统结构和基因调控机制的理想材料。目前，对于大白菜叶色深绿的分子机制研究鲜有报道。软腐病作为大白菜三大病害（软腐病、霜霉病、病毒病）之一，在田间发病严重，可影响大白菜的产量和品质。目前，由于缺乏高抗软腐病的育种材料，关于大白菜抗软腐病调控机制尚不清楚。 本研究以大白菜EMS突变体库中筛选出的一株叶色深绿突变体dg为试材，研究其光合相关生理特性，分析突变性状遗传特性，并利用MutMap技术定位突变位点;通过遗传转化技术将突变体和野生型中的目标基因过表达到野生型A03植株中，观察转基因植株表型;借助转录组测序(RNA-Seq)技术，在表达水平揭示突变基因调控机制;通过分析野生型A03及突变体dg叶绿体中蛋白表达水平，并检测二者类囊体膜蛋白及原核表达蛋白的催化效率，解析突变基因在翻译水平的表达调控机制。旨在揭示突变基因功能，明确突变基因影响叶色深绿的分子机制。 同时，以大白菜EMS突变体库为材料，通过离体及活体接种软腐病菌（Pectobacterium carotovorum ssp.carotovorum，Pcc）筛选，建立大白菜适宜的抗性分级评价体系，筛选大白菜抗软腐病突变体;以筛选出的1株抗软腐病突变体sr为材料，利用RNA-Seq技术，揭示大白菜防御软腐病相关基因的表达调控机制;检测侵染前后重要次生代谢产物及内源激素的含量变化，结合转录组分析结果，阐释大白菜防御软腐病的分子作用机理。 主要研究结果如下: 1.在生殖生长期和营养生长期，突变体dg叶色皆为深绿色，其生长速率高于野生型，叶绿素a和b含量极显著增加，叶绿素a/b比值降低。光合特性研究表明，深绿色突变体dg捕光能力和弱光下光吸收能力增强，光合速率及光合系统实际光能转换效率皆高于野生型。 2.大白菜叶色深绿突变体dg突变性状受一对隐性基因控制。利用MutMap测序技术将突变位点定位于A09染色体46905384 bp处，该位点由C突变成T。突变基因注释为BrFC2，其CDS区1391bp处由G突变成A，相对应的在第465个氨基酸，由精氨酸（Arginine，R）突变为赖氨酸(Lysine，K)。克隆BrFC2基因测序与KASP分析初步验证该位点为候选突变位点。 3.过表达突变基因BrFC2-dg到野生型A03中，转基因株系叶片表现深绿色，与突变体dg表型性状一致。但将野生型基因BrFC2-WT过表达到野生型A03中，表型未有改变。进一步验证BrFC2基因突变位点即为突变体dg叶片颜色突变为深绿色的主要原因。 4.通过测定叶绿素合成相关物质发现，血红素含量在叶色深绿突变体dg中含量极显著增加，叶绿素合成途径中5个重要物质ALA、PBG、ProtoIX、Mg-ProtoIX和Chlide在突变体dg中含量增加，可能与叶绿素含量上升密切相关。转录组分析结果表明，BrFC2表达量在野生型A03和突变体dg中无差异，在叶绿素及血红素合成途径中仅有1个基因CLH1表达上调。同时叶色深绿突变影响光合系统Ⅰ和光合系统Ⅱ中多个与光氧化、光系统亚基和捕光蛋白复合物相关基因表达下调。 5.在野生型A03及突变体dg中BrFC2蛋白表达量差异不显著。在卟啉和叶绿素代谢途径中2个蛋白表达量下调;光合作用-天线蛋白途径中4个蛋白表达量上调。FC2蛋白保守motifs分析结果显示，叶色深绿突变位点发生在C端由42个氨基酸组成的保守motif。比较BrFC2-WT和BrFC2-dg氨基酸序列二级结构发现，BrFC2-dg较BrFC2-WT多1个构成无规则卷曲的氨基酸，少1个构成延伸链的氨基酸。 6.亚细胞定位结果显示，BrFC2-dg-GFP融合蛋白定位于在叶绿体中。野生型A03和突变体dg类囊体膜蛋白（含BrFC2）及原核表达BrFC2-WT和BrFC2-dg蛋白的催化效率结果显示，无论突变体dg类囊体膜蛋白还是原核表达突变蛋白BrFC2-dg的催化效率都极显著高于野生型。 7.通过离体和活体两种鉴定方法，从800株大白菜EMS突变体中筛选出1株抗软腐病突变体sr，野生型A03活体及离体病情鉴定级别均为9级，为软腐病易感型;抗软腐病突变体sr活体及离体病情鉴定级别均为1级，为抗软腐病突变体。 8.利用RNA-Seq技术，在接种后0、6、12和24小时内，分析抗软腐病突变体sr和野生型A03对Pce的调控差异表达基因。抗软腐病突变体sr和野生型同时侵染12h后，差异表达基因数目最多，为512个（上调基因421个、下调基因91个）。初步明确了接种6-12h可能是大白菜对软腐病菌防卫的重要调控期。病原菌模式激发免疫反应(Pathogen pattern-triggered immunity，PTI)在植物对Pcc的防御中扮演着核心防御角色，由病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，M/PAMPs)或损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns，DAMPs）通过细胞膜表面的模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）触发的，进而引起一系列的免疫反应。Pcc可刺激寄主植物增加内源激素茉莉酸(Jasmonic acid，JAs)的含量，JAs的积累参与了大白菜对Pcc的免疫反应，茉莉酸/乙烯(Jasmonic acid/Ethylene，JA/ET)作为正向调节信号可以增强对Pcc的抗性。水杨酸(Salicylic acid，SA)介导的激素信号传导通路参与对Pcc防御反应可能是通过抑制吲哚乙酸(Indole-3-aceticacid, IAA)信号参与激活对Pcc的防御反应。外源性生长素、茉莉酸甲酯(Methyljasmonate，MEJA)和苯并噻二唑(Benzothiadiazole，BTH)的喷施也证实激素在免疫系统中的作用。 9.吲哚族和芳香族硫甙在大白菜抗软腐病突变体sr中积累并发挥防御Pcc的功能。在大白菜受到Pcc侵染后，硫甙和木质素合成基因表达上调，硫甙和木质素含量提高可增强对病原菌的抗性。

目录

声明

摘要

缩略表

引言

1．EMS诱变芸薹属作物创制突变体

2．EMS突变体功能基因鉴定技术

3．叶色突变体的研究进展

3．1植物叶色突变体的来源

3．2植物叶色突变体的类型

3．3植物叶色突变体的遗传特点

3．4植物叶色突变体的分子机理

4．大白菜抗软腐病研究进展

4．1欧文氏软腐病菌的致病机制

4．2植物抗软腐病抗性防御机制

4．3植物抗软腐病防卫信号传导

5．本研究的目的与意义

第一章大白菜叶色和抗软腐病突变体的筛选及叶色深绿突变体dg光合特性鉴定

1．材料与方法

1．1试验材料

1．2试验方法

2．结果与分析

2．1大白菜叶色突变体表型特征及叶绿素含量

2．2野生型A03和深绿色突变体dg在不同生长阶段表型特征

2．3野生型A03和深绿色突变体dg叶绿素含量

2．4野生型A03和深绿色突变体dg叶绿素荧光参数分析

2．5野生型A03和深绿色突变体dg光合特性分析

2．6大白菜软腐病抗性活体接种分级标准

2．7大白菜软腐病抗性离体接种分级标准

2．8大白菜EMS突变体库软腐病发病情况统计

2．9大白菜抗软腐病突变体的筛选

3．讨论

3．2大白菜软腐病抗性鉴定方法的选择

4．小结

第二章大白菜叶色深绿突变基因的遗传分析及鉴定

1．材料与方法

1．1试验材料

1．2试验方法

2．结果与分析

2．1大白菜叶色深绿突变基因的遗传特性分析

2．2 MutMap定位叶色深绿突变基因

2．3大白菜叶色深绿突变基因BrFC2-dg的克隆

2．4大白菜叶色深绿突变位点在F2群体中的验证

2．5过表达BrFC2-dg-CDS和BrFC2-WT-CDS载体构建

2．6转基因植株验证叶色深绿突变基因BrFC2功能

2．7大白菜叶色深绿突变基因BrFC2亚细胞定位

3．讨论

3．1 MutMap混池测序定位候选基因

3．2单碱基突变位点改变可影响植物表型

4．小结

第三章大白菜叶色深绿突变基因BrFC2-dg的表达调控分析

1．材料与方法

1．1试验材料

1．2试验方法

2．结果与分析

2．1野生型A03和叶色深绿突变体dg转录组测序质量评价

2．2转录组差异表达基因注释和分析

2．3 RT-qPCR验证转录组数据差异表达基因注释和分析

2．4野生型A03和叶色深绿突变体dg血红素及叶绿素前体物质含量

3．讨论

3．2 BrFC2-dg突变基因影响植物光合系统蛋白复合物编码基因表达

4．小结

第四章大白菜叶色深绿突变基因BrFC2-dg的蛋白调控分析

1．材料与方法

1．1试验材料

1．2试验方法

2．结果与分析

2．1野生型A03与叶色深绿突变体dg叶绿体蛋白iTRAQ定量分析

2．2 BrFC2-dg和BrFC2-WT蛋白结构预测及理化性质分析

2．3叶色深绿突变体dg与野生型A03类囊体膜中BrFC2蛋白催化效率

2．4原核表达BrFC2-dg及BrFC2-WT蛋白催化效率

3．讨论

4．小结

第五章大白菜突变体sr防御软腐病抗性表达调控机制

1．材料与方法

1．1试验材料

1．2试验方法

2．结果与分析

2．1大白菜突变体sr软腐病抗性表达调控机制分析

2．2接种Pcc12小时后野生型和抗软腐病突变体sr硫甙含量变化

2．3接种Pcc12小时后野生型和抗软腐病突变体sr木质素含量变化

2．4接种Pcc12小时后野生型和抗软腐病突变体sr内源生长素、茉莉酸、水杨酸含量变化

2．5外施激素对大白菜软腐病抗性影响

2．6大白菜抗软腐病突变体sr响应软腐病菌抗性调控机制推测

3．讨论

3．1假定的大白菜-软腐病菌(Pcc)相互作用免疫机制

3．2硫甙参与正向调控抗软腐病免疫反应

3．3 SA、JA和ET在防御反应中作为转导信号在抗软腐病突变体中积累

3．4木质素在免疫反应中可防止寄主植物病斑扩散

4．小结

全文结论

参考文献

附表

在读期间发表的论文

作者简历

致谢