重组蛋白药物临床前生物活性及含量检测技术研究

摘要

人脑利钠肽(Human Brain Natriuretic Peptide，hBNP)又称B型利钠肽(B-type Natriuretic Peptide)，是心室分泌的具有代偿功能的一种内源性多肽，通过舒张血管，促进排钠、排尿，抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，从而降低心脏前、后负荷，改善充血性心力衰竭(Congestive Heart Failure，CHF)患者的血流动力学指标，起到维护心功能的作用。国内外已将rhBNP(Recombinant Human Brain Natriuretic Peptide，rhBNP)列为急性心衰一线治疗药物。另外，由于心衰患者体内BNP浓度发生显著的变化，血浆中BNP含量的检测也己被国内外列为临床诊断和预后评估的重要指标。
　　本研究主要针对以下三个部分进行探索研究。
　　1.建立双抗体夹心酶联免疫吸附法(Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，用于测定rhBNP给药后，不同时间动物血药浓度的检测。并对该方法进行了优化，完成方法学验证，目前该方法已用于在研rhBNP产品临床前动物药代研究。
　　2.hBNP与特异性受体结合，激活鸟苷酸环化酶，引起细胞内环单磷酸鸟苷(cGMP)的浓度升高，作为第二信使，cGMP在细胞内进一步发挥生物学作用。因此，测定细胞内cGMP变化，可以反应hBNP的生物学活性。该研究与中检院合作，通过建立稳定转染hBNP受体基因的单克隆细胞系，建立竞争性酶联免疫吸附法(Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)，并完成方法学验证，目前该方法己应用于rhBNP产品的生物活性检测。
　　3.通过给新西兰兔耳缘静脉滴注戊巴比妥钠，建立新西兰兔急性心衰模型，心衰造模成功的新西兰兔给予高、中、低不同剂量的自制rhBNP，通过测定血流动力学参数以及血浆肌酸激酶和乳酸脱氢酶活性，对在研产品在动物体内的药效进行了初步研究。结果表明，在研rhBNP产品具备与原研药物相同的治疗作用。
　　本课题的研究结果为rhBNP临床前研发工作的顺利完成打下了基础。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 研究背景及意义

1．1．1 脑利钠肽：分子结构及生理功能、作用机制

1．1．2 脑利钠肽的临床应用

1．2 主要研究内容

1．2．1 ELISA在血药浓度检测中的方法建立与应用

1．2．3 rhBNP在新西兰兔体内生物学作用研究

1．3 ELISA基本原理及技术

1．3．2 抗原抗体反应与主要免疫检测技术

1．3．3 基于转BNP受体基因细胞的ELISA药物活性检测

第2章 ELISA在rhBNP血药浓度检测中的方法建立

2．1．1 主要试剂耗材

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂配制

2．2 方法的建立

2．2．1 抗体制备

2．2．2 间接竞争法建立

2．2．3 直接竞争法建立

2．2．4 双抗体夹心法建立

2．3 实验方法

2．3．2 直接竞争法

2．3．3 双抗体夹心法

2．4 动物实验

2．5 结果与讨论

2．5．1 间接竞争法

2．5．2 直接竞争法

2．5．3 双抗体夹心法

2．5．4 动物实验

2．6 本章小结

第3章 ELISA在rhBNP活性测定中的应用

3．1．1 主要试剂耗材

3．1．3 主要试剂配制

3．1．4 实验方法

3．1．5 方法学验证

3．2．1 线性与范围

3．2．2 精密度

3．2．3 专属性

3．2．4 耐用性

3．2．5 准确性

3．3 批检验结果

3．4 本章小结

第4章 rhBNP在新西兰兔体内生物学作用研究

4．1．1 主要试剂耗材

4．1．2 主要仪器

4．1．3 主要试剂配制

4．1．4 实验方法

4．1．5 统计学分析

4．2 结果与讨论

4．2．1 rhBNP对急性心衰新西兰免血流动力学指标的影响

4．2．2 rhBNP对急性心衰新西兰兔血浆心肌酶的影响

4．3 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间所发表的论文

致谢

个人简历