骨形成蛋白4通过激活细胞自噬与ERK1/2信号通路诱导大鼠H9C2心肌细胞肥大的机制

摘要

心肌肥大是心血管疾病发生和死亡的一个独立危险因素，对人类的生命健康构成严重威胁。因此，探索心肌肥大的刺激因素及其作用机制可能为治疗心肌肥大提供有益的帮助。目前的研究认为机械应激及多种神经、体液因子如：内皮素、血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）等均可诱导心肌肥大。骨形成蛋白4（bone morphogenetic protein4，BMP4）是TGF-β超家族中的一员，有研究证明BMP4可促进病理性心肌肥大，但其具体的调控机制尚不清楚。自噬是对变性蛋白质与受损细胞器进行降解的过程，广泛存在于真核细胞中，在维持细胞生存、分化和稳态中具有重要意义。近年，自噬在心肌肥大中的作用备受关注，但其具体分子机制还不清楚。细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）信号通路在心肌肥大中扮演着重要角色。因此，我们推测BMP4可能通过调节细胞自噬激活ERK1/2信号通路诱导了心肌细胞肥大。 目的：观察BMP4对H9C2心肌细胞的影响，探讨细胞自噬在BMP4诱导大鼠H9C2心肌细胞肥大中的作用与机制，为临床循证治疗心肌肥大提供一定的实验基础与理论依据。 方法：培养大鼠H9C2心肌细胞。首先，建立BMP4诱导的大鼠H9C2心肌细胞肥大模型，随机将细胞分为正常对照（Con）A组、BMP4（50μg/L）A组、AngⅡ（1×10-7mol/L）组，培养48h。其次，观察以50μg/L的BMP4作用不同时间（0min、10min、30min、60min、120min）及以不同浓度（0μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L）的BMP4作用30min后大鼠H9C2心肌细胞ERK1/2蛋白磷酸化(p-ERK1/2)表达的变化。随后，将H9C2心肌细胞随机分为4组：正常对照（Con）B组、BMP4B组、BMP4+ERK1/2信号通路抑制剂（PD98059）A组、BMP4+自噬抑制剂（3MA）A组，PD98059与3MA终浓度分别为50μmol/L与5mmol/L阻断30min后加入浓度为50μg/L的BMP4。各组继续培养30min后提取总蛋白分别检测微管相关蛋白l轻链3(tiny tubes related proteins1light chain3，LC3)与p-ERK1/2的表达；最后，深入观察阻断细胞自噬与ERKl/2信号通路后H9C2心肌细胞的变化，随机将细胞分为正常对照C组、BMP4C组、BMP4+PD98059B组、BMP4+3MA B组，PD98059与3MA阻断30min后加入BMP4继续培养48h。倒置显微镜观察细胞形态大小，Image J软件测量细胞面积，BCA法测细胞总蛋白含量，Western blot检测p-ERK1/2、LC3及心肌细胞肥大标志物脑钠尿肽(brain natriuretic factor or peptide，BNP)、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达。 结果：1.BMP4干预后H9C2心肌细胞面积、蛋白含量、BNP蛋白表达水平均显著大于正常对照A组（744.85±1.31比649.74±2.03，340.09±2.14比243.18±3.69，0.96±0.55比0.72±0.44，P＜0.01），小于AngⅡ组（P＜0.05）。2.BMP4（50μg/L）干预30min后p-ERK1/2表达高于10min（1.09±0.59比0.95±0.96，P＜0.05），尤以0min、60min和120min为著(1.09±0.59比0.67±0.68、0.86±0.85、0.63±0.68，P＜0.01）而0min与120min无明显差异（P＞0.05）。BMP4不同浓度干预心肌细胞，100μg/L干预后p-ERK1/2表达明显高于0μg/L、10μg/L、50μg/L（1.00±0.46比0.54±0.32、0.61±0.38、0.78±0.40，P＜0.01）。3.30min后，与Con B组相比，BMP4B组LC3、p-ERK1/2蛋白表达均显著增强[（1.54±0.05)vs(1.95±0.11)，(0.94±0.04)vs(1.33±0.06)，P＜0.01]；与BMP4B组相比，BMP4+PD98059A组、BMP4+3MA A组LC3表达与p-ERK1/2均显著降低[(1.95±0.11)vs（1.59±0.08）、（1.36±0.02），(1.33±0.06)vs（0.87±0.05）、(0.95±0.15)，P＜0.01]；而BMP4+PD98059A组与BMP4+3MA A组相比，LC3与p-ERK1/2蛋白表达均无明显变化（P＞0.05）。48h后，与Con C组相比，BMP4C组细胞表面积、平均蛋白含量、α-SMA的蛋白表达水平均显著增加[(644.1±15.01)μm2vs(745.6±14.43)μm2，(240.0±7.26)pg/cell vs(347.1±5.4)pg/cell，(1.22±0.06vs1.99±0.03)，P＜0.01]，与BMP4C组相比，BMP4+PD98059B组、BMP4+3MA B组细胞面积、平均蛋白含量、α-SMA的蛋白表达水平均显著减少[(745.6±14.43)μm2vs(645.0±12.63)μm2、(647.7±13.89)μm2，(347.1±5.4)pg/cell vs(239.7±3.39)pg/cell、(241.1±8.56)pg/cell，(1.99±0.03)vs(1.13±0.05)、(1.12±0.02)，P＜0.01]。而BMP4+PD98059B组与BMP4+3MA B组相比三者均无明显差异（P＞0.05）。 结论：1.BMP4可能通过激活ERK1/2信号通路诱导大鼠H9C2心肌细胞肥大； 2.BMP4诱导心肌肥大中激活了细胞自噬 3.ERK1/2可能调节了细胞自噬 4.细胞自噬可能通过激活ERK1/2信号通路介导了BMP4诱导大鼠H9C2心肌细胞肥大 4.细胞自噬可能通过激活ERK1/2信号通路介导了BMP4诱导大鼠H9C2心肌细胞肥大 5.阻断细胞自噬或ERK1/2信号通路的激活，可能对心肌肥大有治疗作用。

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