嵌合共刺激转换受体改造NK-92细胞及抗肿瘤免疫效应研究

摘要

近年来，肿瘤免疫细胞治疗因其显著的疗效而在肿瘤治疗中备受瞩目，特别是基于嵌合抗原受体改造的T细胞（CAR-T），在血液系统恶性肿瘤的临床治疗展现出良好的靶向性、杀伤力和持久性，使之成为肿瘤免疫治疗领域最令人信服的突破。然而，尽管CAR-T技术研发不断取得进步，但依然面临着诸多挑战，主要障碍之一为CAR-T虽然具备强大的杀死癌细胞的能力，但其本身所引起的过强免疫应答反应潜在威胁患者生命，并且无论CAR-T或是TCR-T（T细胞受体嵌合型T细胞）等免疫细胞技术，迄今为止对实体瘤的治疗鲜有奏效。NK细胞是除T、B淋巴细胞外，又一重要的免疫细胞，在实体瘤发生发展的早期免疫反应和免疫监视过程中发挥重要作用。相比T细胞，NK细胞具有许多自身的免疫特性和优势。 目的： 本研究通过设计构建嵌合共刺激转换受体（Chimeric Costimulatory Converting Receptor，CCCR）对NK-92细胞进行改造，研究其对实体瘤的特异性识别及抗肿瘤效应。 方法： 通过PCR及常规分子克隆技术合成CCCR编码基因PD1-NKG2D-41BB，使用慢病毒载体，得到重组载体PD1-NKG2D-41BB-pCDH，然后进行慢病毒包装，将得到的病毒侵染NK-92细胞，获得稳定表达所述嵌合共刺激转换受体的抗肿瘤NK-92细胞（即CCCR-NK92细胞）。采用流式细胞术检测CCCR-NK92细胞上PD-1、CD56、CD16的表达；CCK8法比较CCCR-NK92与NK-92细胞的增殖速率；乳酸脱氢酶（LDH）法比较CCCR-NK92与NK-92细胞对肿瘤细胞H1299、EMT6的杀伤效果；Hoechst33342染液检测细胞凋亡；建立人肺癌NOG小鼠皮下移植瘤模型，观察CCCR-NK92细胞在体内的抑瘤效果。 结果： 1.成功构建获得稳定表达嵌合共刺激转换受体PD1-NKG2D-41BB的抗肿瘤NK-92细胞（即CCCR-NK92细胞）； 2.流式细胞术验证CCCR-NK92细胞中PD-1的表达率为57.4%，而亲本NK92细胞中PD-1几乎不表达； 3.流式细胞术结果表明，亲本NK-92细胞与CCCR-NK92细胞中，NK-92的特征性表型CD16均不表达，其另一表型CD56在NK-92细胞以及CCCR-NK92细胞中均有表达； 4.CCCR-NK92细胞的增殖水平与亲本NK-92相比并无差异性变化，证明对NK-92的改造并未影响其增殖速率（P＞0.05）； 5.在LDH细胞毒性检测中，不同的效靶比例下，CCCR-NK92的细胞毒性均高于亲本NK92（P＜0.001），而在效靶比为5：1的比例下，CCCR-NK92的细胞毒性更是亲本NK92的3~4倍； 6.在凋亡实验中，CCCR-NK92细胞在杀伤肿瘤细胞后，出现凋亡的细胞数是NK-92细胞的2倍之多（P＜0.001）； 7.在人肺癌NOG小鼠皮下移植瘤模型中，将CCCR-NK92细胞作为药物对小鼠进行治疗，同时设置PBS对照组与NK-92对照组，每两天对小鼠肿瘤大小进行测量，并绘制曲线，通过数据分析，接受CCCR-NK92细胞治疗的小鼠的肿瘤体积明显小于PBS组与NK-92细胞治疗组（P＜0.05）。 结论： 成功构建含有嵌合共刺激转换受体PD1-NKG2D-41BB的NK-92细胞（即CCCR-NK92细胞），并通过体内、外实验证明，CCCR-NK92细胞的抗肿瘤效应明显高于亲本NK-92细胞。

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