microRNAs在恶性黑色素瘤B16F0和B16F10细胞中差异表达的研究及miR-763对B16F10细胞增殖的影响

摘要

恶性黑色素瘤（malignant melanoma,MM）是一种皮肤肿瘤，其是由来源于神经脊的黑色素细胞异常增生而产生的，一旦产生并进入快速生长期，则具有易侵袭、易转移、预后差、死亡率高等特点。microRNA(miRNA)是一类长度为21-25nt的内源性非编码单链RNA,它们通过与靶基因mRNA的3＇UTRs（非编码区）或编码区的特异性结合，从而调控靶基因的表达。本课题旨在探究miRNA在恶性黑色素瘤B16F0和B16F10细胞中的差异表达情况及过表达miR-763对B16F10细胞的影响[1]。 目的: 1.探讨恶性黑色素瘤B16F0和B16F10细胞miRNA的差异表达情况； 2.探讨miR-763对恶性黑色素瘤B16F10细胞的影响及潜在分子机制； 方法: 使用恶性黑色素瘤B16F0和B16F10细胞作为研究对象，构建动物模型。 1.观测在体内和体外恶性黑色素瘤B16F0和B16F10细胞迁移、侵袭和增殖方面的差异； 2.检测恶性黑色素瘤B16F0和B16F10细胞miRNA的表达情况，并利用生物信息学分析其差异性； 3.利用Real-time PCR技术检测小鼠黑色素瘤细胞miR-763、miR-431-5p、miR-205-5p、let-7C-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-28b、miR-29b-3p和miR-24-2-5p的表达水平，验证miRNA芯片结果的准确性。 4.在恶性黑色素瘤B16F10细胞过表达miR-763，观测其对B16F10细胞增殖的影响； 5.检测生物信息学预测的miR-763靶基因的表达变化，利用激酶磷酸化特异性抗体检测各个信号通路中的关键激酶的磷酸化水平变化，确定miR-763通过靶基因影响哪些信号通路进而对B16F10细胞产生影响。 结果： 1.恶性黑色素瘤B16F10细胞在体外的迁移、侵袭和增殖能力高于B16F0细胞。 2.通过生物信息学分析发现恶性黑色素瘤B16F0和B16F10细胞在miRNA表达水平存在明显的差异性。 3.Real-time PCR检测发现小鼠黑色素瘤细胞miR-763、miR-431-5p、miR-205-5p、let-7C-2-3p表达水平下调，miR-26a-1-3p、miR-28b、miR-29b-3p和miR-24-2-5p表达水平上调，结果与芯片结果相一致，miRNA芯片结果准确可信。 4.过表达miR-763可以抑制恶性黑色素瘤B16F10细胞的体外增殖。 5.miR-763下调潜在靶基因Grb2的表达，进而影响下游分子Cyclin D1的变化。 结论： 1.生物信息学分析发现两株细胞之间在miRNA表达水平存在显著差异，这可能是恶性黑色素瘤B16F10与B16F0细胞迁移、侵袭和增殖能力差异的重要原因。 2.miR-763可能通过靶向调节Grb2的表达，抑制恶性黑色素瘤B16F10细胞的增殖。

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