小鼠GABRR2基因克隆表达及CRISPR/Cas9介导的基因编辑

摘要

背景： GABA是哺乳类动物中枢神经系统主要的抑制性神经递质，GABA受体也是临床上重要的神经活性化合物的主要靶点。GABAc受体是视网膜组织中关键的调节性受体，研究表明，激活的GABAC受体能够抑制双极神经元与神经节细胞之间的谷氨酸释放，以此来调节视网膜的动态变化。视网膜病变引起的视神经疾病是眼科疾病中的急症和重症，对视网膜病变这一大类视神经病变过程中的新靶标、新途径的研究仍不全面。本研究应用小鼠视网膜神经节细胞（RGC-5）成功构建GABAc受体Rho2基因（GABRR2）过表达及敲除细胞系，建立了GABAC离子通道结构及功能筛选平台,为体外阐述GABAC受体结构功能以及受体同药物的相互作用奠定基础，以期为疾病干预和药物设计提供新靶标和新思路。 目的： 构建GABRR2基因过表达稳定细胞系以及GABRR2基因敲除细胞系，研究基因编辑后的双倍体成体细胞详细的基因型与表现型，以及基因编辑对GABRR2基因外显子剪切的作用。 方法： (1)分别以pCMV6-Entry-mRho2以及pIRES-eGFP表达质粒为模板，通过快速克隆法[1]构建质粒，利用Lipo6000TM转染试剂转染RGC-5细胞，建立稳定表达GABRR2的RGC-5细胞系。荧光显微镜及流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达，并采用Realtime-PCR检测GABRR2的表达。 (2)基于mRho2基因外显子5、6设计4对不同的sgRNA寡链核苷酸序列，构建Cas9/sgRNA表达质粒。重组质粒转染RGC-5细胞，利用T7E1酶检测打靶效率。基于有限稀释法获得单克隆细胞系，联合DNA测序技术检测敲除细胞系的基因型及mRNA型。 (3)基于mRho2基因外显子5、6设计上下游同源臂，并与pHomoRecom质粒连接，获得重组质粒pHomoRecom-E5E6。与Cas9/sgRNA4共转染细胞，经G418联合GCV抗性筛选，通过有限稀释法获得同源重组型单克隆细胞系，联合DNA测序技术检测敲除细胞系的基因型。 结果： (1)成功构建pIRES-eGFP-mRho2表达质粒，获得GABRR2基因过表达稳定细胞系。 (2)重组质粒Cas9/sgRNA1、Cas9/sgRNA2、Cas9/sgRNA4均可对GABRR2基因进行编辑。利用Cas9/sgRNA4质粒转染细胞，获得9株非同源重组型GABRR2基因敲除细胞系，详细阐述CRISPR/Cas9介导的基因编辑对GABRR2外显子剪接的影响。 (3)成功构建重组质粒pHomoRecom-E5E6，获得同源重组型GABRR2基因敲除细胞系。 结论： 成功构建GABRR2基因表达系以及两种GABRR2基因敲除系，为GABAC离子通道基因功能研究及药物筛选建立细胞研究平台，为进一步研究视网膜病变过程中GABAC离子通道的功能提供重要的实验基础。同时，本课题深入研究了CRISPR/Cas9在双倍体细胞基因编辑中的应用和快速筛选，阐述了基因编辑技术对基因外显子剪切的影响，为基因编辑技术的应用提供参考。

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