二吡啶酮腙二硫代丁酸对人胃癌细胞系生长抑制的机制

摘要

胃癌是一种最常见的恶性肿瘤，位于全世界癌症死亡率中第二位。化疗药物虽是肿瘤治疗的重要手段，但毒副作用及药抗的产生，迫使人们寻找新的治疗策略。铁螯合治疗是抗肿瘤药物研究的热点之一。 过渡金属,如铜、铁等在细胞的生长增殖中发挥重要作用。二硫代氨基甲酸盐是一类对过渡金属有强络合能力的金属螯合剂，参与调节细胞凋亡、氧化应激等过程。但二硫代氨基甲酸盐因其对金属的亲和力使酶失活，酶又是生命体内重要的生物大分子，大部分酶依赖金属离子发挥功能。因此需要对二硫代氨基甲酸盐进行结构修饰制备出其衍生物，吡咯烷二硫代氨基甲酸是其衍生物之一，其抗肝癌细胞增殖作用已经得到证明。二吡啶酮腙二硫代丁酸（dipyridylhydrazone dithioc arbamte butyric acid ester，DpdtbA）也是二硫代氨基甲酸盐的衍生物之一，它对胃癌的抑制作用尚未探讨。 目的： 探讨DpdtbA对人胃癌MGC-803细胞和SGC-7901细胞生长的影响，揭示其影响胃癌细胞生长的机制。 方法： 1.DpdtbA用化学合成法将不同功能的结构单元连接获得，经磁共振及质谱表征确认其结构。用DMSO作为溶剂，配成溶液。常规培养人胃癌MGC-803细胞和SGC-7901细胞。 2.MTT法检测细胞增殖，检测DpdtbA对细胞生长的影响时，分为8个实验组和1个DMSO组；检测ROS是否与DpdtbA对细胞生长影响有关时，NAC作用细胞2h后，再将细胞分为8个实验组和1个DMSO组。实验组加入终浓度分别为0.15μM、0.3μM、0.6μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM DpdtbA，DMSO组只加DMSO。并在倒置显微镜下观察DpdtbA作用细胞48h之后细胞形态的变化并拍照记录。 3.用DCFH-DA孵育细胞，经流式细胞分析术（flow cytomeay，FCM）检测DpdtbA对细胞活性氧的影响，分为3个实验组、DMSO组和空白对照组，实验组分别加入终浓度为2.5μM、5μM、10μM的DpdtbA，空白对照组不做处理。 4.用Annexin V-FITC和PI染色经FCM检测DpdtbA对细胞凋亡的影响，分组与干预同细胞活性氧检测。 5.用罗丹明123经FCM检测DpdtbA对细胞线粒体膜电位的影响，分组与干预同细胞活性氧检测。 6.Western Blot检测凋亡相关蛋白（casepase8、p53、Cyt c、Bax、Bcl-2）、Cath D、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的变化，测量并计算Bax/Bcl-2值。DpdtbA对凋亡相关蛋白影响检测：将细胞分为3个实验组和DMSO组，实验组分别加入终浓度为1.25μM、2.5μM、5μM的DpdtbA；DpdtbA对MGC-803细胞Cath D影响检测，将细胞分为2个实验组和DMSO组，实验组分别加入终浓度为2.5μM、5μM的DpdtbA。ROS是否与DpdtbA对凋亡相关蛋白影响有关检测分为DpdtbA+NAC组、DpdtbA组和DMSO组。p53是否与DpdtbA对凋亡相关蛋白影响有关检测分为DpdtbA+PFT-α组、DMSO+PFT-α组、DpdtbA组和DMSO组，ROS是否与DpdtbA诱导MGC-803细胞自噬相关检测分为DpdtbA+NAC组、DpdtbA+3-MA组、DpdtbA组、NAC组、3-MA组和DMSO组，以上各组依据干预药物命名。 7.用Lyso-Tracker Red染色、荧光显微镜下观察DpdtbA对MGC-803细胞溶酶体膜通透性的变化，分为实验组、DMSO组共3组，实验组分别加入终浓度为2.5μM、5μM DpdtbA。 8.用免疫荧光检测DpdtbA对MGC-803细胞Cath D影响，分为实验组、DMSO组共2组，实验组加入终浓度为2.5μM的DpdtbA。 9.吖啶橙染色、荧光显微镜下观察DpdtbA对MGC-803细胞自噬小体的影响，DpdtbA对细胞自噬的检测，分为2个实验组和1个DMSO组；DpdtbA对细胞的自噬是否可以被自噬抑制剂3-MA影响的检测，3-MA作用细胞2h后，再将细胞分为2个实验组和1个DMSO组。实验组分别加入终浓度为2.5μM、5μM的DpdtbA。 10.用PI染色的FCM检测DpdtbA对细胞周期的影响，分为实验组、DMSO组和空白对照组共4组，实验组分别加入终浓度为2.5μM、5μM、的DpdtbA，空白对照组不做处理。 11.用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，数据采用均数±标准差表示，均数的比较采用方差分析，检验水准α=0.05。 结果： 1.DpdtbA抑制人胃癌细胞生长，对MGC-803细胞的IC50为（3.80±0.40)μM，对SGC-7901细胞的IC50为（4.20±0.52）μM。 2.DpdtbA诱导细胞ROS增多抑制MGC-803和SGC-7901细胞生长，DpdtbA作用1.5h后，DCFH-DA荧光增强的细胞增多，随着DpdtbA浓度的增大，荧光逐渐增强，表明细胞内ROS产逐渐增多，具有浓度依赖性关系。用ROS清除剂NAC作用2h后，DpdtbA对MGC-803和SGC-7901细胞生长抑制减弱。与没有清除ROS之前相比，DpdtbA对MGC-803细胞的IC50值增加了3倍，20μM的DpdtbA对SGC-7901的抑制率仅为30%。 3.DpdtbA诱导MGC-803和SGC-7901细胞凋亡。DpdtbA作用MGC-803和SGC-7901细胞24h后，细胞早期凋亡率与晚期凋亡率随着DpdtbA浓度的增加均增多，以早期凋亡率改变明显；Rh123荧光也随着DpdtbA浓度的增大荧光逐渐增强，表明细胞凋亡具有浓度依赖性关系。 4.DpdtbA可影响细胞凋亡相关蛋白表达。DpdtbA作用MGC-803和SGC-7901细胞24h后，随着DpdtbA的浓度增高，细胞内蛋白p53、Cyt c、caspase8、Bax的表达增加，Bcl-2的表达减少。半定量分析显示Bax/Bcl-2的比值逐渐升高，DpdtbA作用后细胞的Bax/Bcl-2比值高于DMSO组（P＜0.05）。 5.DpdtbA影响细胞凋亡相关蛋白表达与ROS密切相关。ROS清除剂NAC作用2h、DpdtbA作用24h后，DpdtbA+NAC组的细胞内蛋白p53、Cyt c、caspase8、Bax表达低于DpdtbA组，高于DMSO组；Bcl-2的表达高于DpdtbA组，低于DMSO组；半定量分析显示Bax/Bcl-2的比值低于DpdtbA组，高于DMSO组（P＜0.05）。 6.p53调控DpdtbA诱导的细胞凋亡。p53抑制剂PFT-α作用2h后加入DpdtbA作用24h，DpdtbA+PFT-α组的p53蛋白表达低于DpdtbA组，DMSO+PFT-α组也低于DMSO组，提示PFT-α抑制了p53蛋白表达。随着p53蛋白表达降低，细胞Cyt c、Bax、caspase8的表达减少，Bcl-2的表达增加。半定量分析显示Bax/Bcl-2的比值由高到低依次为DpdtbA组、DpdtbA+PFT-α组、DMSO组和DMSO+PFT-α组（P＜0.05）。 7.DpdtbA诱导MGC-803细胞溶酶体膜通透性改变和酶释放。DpdtbA作用24h后，和DMSO组相比，MGC-803细胞红色荧光随着DpdtbA浓度的增加而增强。DMSO组细胞的Cath D呈颗粒状聚集，DpdtbA处理后细胞Cath D呈弥散状态；随着DpdtbA的浓度增加，细胞Cath D的量也增加。 8.DpdtbA诱导MGC-803细胞自噬。DpdtbA作用24h后，和DMSO组相比，随着DpdtbA浓度的增加，DpdtbA作用细胞的橘红色荧光增多、增强，说明自噬小体增多。用自噬抑制剂3-MA作用2h、DpdtbA作用24h后，与相同浓度DpdtbA作用的细胞相比，3-MA作用后细胞的橘红色荧光减少。 9.DpdtbA诱导MGC-803细胞自噬与ROS密切相关。培养24h后各组细胞的LC3-Ⅰ的表达变化不大，DpdtbA组LC3-Ⅱ的表达水平最高，DpdtbA+NAC组较低，DpdtbA+3-MA组、NAC组、3-MA组和DMSO组最低。 10.DpdtbA对细胞周期的影响。DpdtbA作用24h后，G1期的MGC-803和SGC-7901细胞增多，且有浓度依赖性，表明DpdtbA将细胞阻滞于G1期。 结论： 1.DpdtbA能够抑制胃癌细胞的生长。 2.DpdtbA抑制胃癌细胞生长的机制主要是诱导产生ROS、激活基因p53，引发细胞凋亡和自噬；还有溶酶体细胞死亡和细胞周期阻滞参与。

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