泡沫分离过程中气-液界面诱导蛋白质聚集机理及抑制研究

摘要

泡沫分离技术，由于其低浓度条件下效率高、成本低和无污染等优点，在降低生物技术下游蛋白质分离成本方面具有极大的潜力。然而，在泡沫分离过程中，大量气-液界面的使用往往诱导蛋白质聚集造成蛋白质功能活性较大程度的损失。这极大的限制了泡沫分离技术在蛋白质分离领域的工业化应用。为了抑制泡沫分离过程中气-液界面诱导的蛋白质聚集，本论文以牛血清白蛋白（BSA）为模拟蛋白，首先从分子水平和聚集动力学两个层面研究了泡沫分离过程中蛋白质聚集的机理及其与分离效果的关系。随后，提出了有效抑制气-液界面诱导蛋白质聚集的方法并对其分子机理进行了研究。最后，对此方法在泡沫分离法提取菠萝皮粗提液中菠萝蛋白酶过程中的应用进行了研究。 首先，以BSA浓度和pH为BSA分子结构改变的诱导因素，研究了BSA分子结构改变与泡沫分离过程中BSA聚集之间的内在关系。结果表明，含有苯丙氨酸残基的疏水区是BSA分子间聚集的作用位点；随着BSA浓度的降低或者溶液pH的降低，BSA分子结构展开程度越大，含有苯丙氨酸残基的疏水区越容易暴露于水溶液当中，BSA分子聚集能力越强，且形成的聚集体的分子量越大；此外，相互聚集的BSA分子间会形成的β折叠结构，BSA分子结构展开程度越大，所形成的β折叠结构的含量越多。 其次，将整个泡沫分离过程分为液相吸附、泡沫上升和消泡三个过程，分别研究三个过程中吸附在气-液界面上BSA质量流量的改变与BSA聚集体产生速率之间的关系，进而分析强化界面吸附和强化泡沫排液对泡沫分离过程中蛋白质聚集动力学的影响。结果表明，在液相吸附和泡沫上升过程中，BSA聚集体产生速率与吸附在气-液界面上BSA质量流量的改变呈线性相关。在消泡过程中，BSA聚集体产生速率由吸附在气-液界面上BSA质量流量的改变和泡沫中吸附在气-液界面上BSA的相对含量共同决定。液相吸附过程是气-液界面诱导蛋白质聚集的限速步骤。强化BSA在气-液界面上的吸附和强化泡沫排液都会增加整个泡沫分离过程中BSA聚集体产生速率，但是强化泡沫排液会导致分子量更大的聚集体形成，甚至是不溶性聚集体的形成。此外，强化泡沫排液使得更多的聚集体倾向于分布在残液当中。 再次，以柠檬酸钠为BSA聚集强化剂，研究气-液界面诱导BSA聚集与BSA分离效果之间的关系。结果表明，强化BSA在气-液界面上的聚集，能增强上升泡沫的稳定性进而减少气泡聚并，因而可以有效提高BSA的回收率，但是同时也会降低BSA的富集比。 随后，用β-环糊精抑制泡沫分离过程中的BSA聚集并对其作用机理进行探讨。结果表明，β-环糊精利用其疏水内腔可包埋BSA分子表面的酪氨酸和苯丙氨酸残基的侧链，同时屏蔽了作用位点附近的疏水基团，因此，β-环糊精有效抑制了泡沫分离过程中气-液界面诱导的BSA聚集，但同时也降低了BSA分子在气-液界面上的吸附进而导致泡沫分离效果的降低。 最后，将β-环糊精用于泡沫分离法提取菠萝果皮粗体液中菠萝蛋白酶的工艺中，研究β-环糊精对菠萝蛋白酶活性回收的影响。结果表明，通过添加β-环糊精（0.40g/L）和强化菠萝蛋白酶的液相吸附，相对于未添加β-环糊精的情况，菠萝蛋白酶的活性富集比、比酶活和活性回收率分别增加了50.5%、71.0%和40.7%。 综上所述，从分子水平和聚集动力学两个层面对气-液界面诱导蛋白质聚集的机理及其与分离效果关系的研究为有效抑制泡沫分离过程中的蛋白质聚集提供了重要的理论支撑。在此基础上，对β-环糊精抑制气-液界面诱导蛋白聚集机理的研究及β-环糊精与强化蛋白质吸附工艺的开发，对减少泡沫分离过程中蛋白质的功能活性损失进而促进泡沫分离蛋白质技术的工业化应用具有实际的指导意义。

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