粘细菌抗肿瘤活性物质筛选及对荷瘤小鼠抑瘤活性和机制研究

摘要

本论文对河北省微生物多样性研究与应用实验室保藏的100株粘细菌的发酵产物进行了体外细胞毒筛选，100个发酵液样品中对人乳腺癌细胞MCF-7有抑制作用的达到82%，说明粘细菌次级代谢产物对肿瘤细胞具有普遍的细胞毒作用。一个好的抗肿瘤药物不仅需要对肿瘤细胞有强大的杀伤作用，而且需对人正常细胞有很小的损害，通过对正常二倍体人胚肺成纤维细胞存活率的测定，选取2#、15#、24#、37#、66#、87#等6株粘细菌的发酵产物，通过利用人子宫颈癌HeLa细胞和人肺腺癌A549进行复筛，结果显示15#菌株发酵产物对A549和HeLa抑制作用较强，72h的IC50分别为6.66μg/mL和14.70μg/mL，且其抑制作用具有较好的时效关系，对人正常二倍体MRC细胞毒性较小，其实验重复性好，初筛和复筛结果相互印证，有开发成为抗肿瘤药物的潜能，选择进行下一步组分分析。
　　选择甲醇和乙腈作为流动相分别对15#菌株发酵代谢产物进行梯度洗脱，通过比较可知乙腈对代谢产物的洗脱能力较强，确定15#菌株发酵代谢产物的最适分离条件为乙腈：水=49:51（体积比），检测波长为350nm，15#菌株发酵产物分离得到了5个组分，对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制实验结果表明：15-1组分具有很好的量效对应关系，当终浓度为100μg/mL时，15-1对人乳腺癌细胞的抑制率分别为71.73%，其它组分的抑制效果则不明显，说明15-1组分抑制肿瘤细胞生长的活性是较强的。
　　菌株91018是本实验室已筛选出来的具有抗肿瘤活性的菌株，根据已摸索好的液相分离条件，制备菌株91018发酵产物单组分91018-1，当终浓度为100μg/mL时，对人子宫颈癌细胞和人乳腺癌细胞的抑制率分别为69.19%和22.59%。
　　荷瘤小鼠抑瘤实验显示91018-1单组分1.25mg/kg剂量组对于小鼠肝癌H22肿瘤细胞的抑瘤率最高，达到48.7%，剂量过大或过小都不利于抑瘤效果。阳性对照环磷酰胺的抑瘤率达到81.3%，但小鼠体征不好。第8天阳性对照组小鼠有一只死亡，说明环磷酰胺的毒性较大，严重影响了小鼠的健康，而1.25mg/kg剂量组小鼠活动自如，皮毛光滑，食量较正常，体重有明显增加。说明1.25mg/kg剂量的91018-1组分对小鼠肝癌H22肿瘤生长有一定的抑制作用，并且对小鼠的毒性较少。流式细胞仪检测发现1.25mg/Kg实验组细胞凋亡率比阴性对照组明显提高，PI细胞增殖指数样品1.25mg/Kg实验组与阴性对照组存在显著差异，说明1.25mg/Kg实验组S和G2/M期的细胞减少，细胞被阻止在G0/G1期，从而影响DNA的合成。1.25mg/Kg样品组与阴性对照组的p53蛋白表达量存在显著差异，说明凋亡通过p53正调控产生，阻止了DNA合成。Bcl-2蛋白表达量与阴性对照相比不存在显著差异，凋亡不是通过Bcl-2蛋白诱导产生。
　　综合利用质谱(GCT-MS、ESI)、氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)、二维谱图(DEPT)等现代波谱技术，对91018-1组分进行结构分析。经解析得知该化合物中文名称为粘噻唑。

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第1章 绪论

1.1 抗肿瘤药物研究的现状与前景

1.2 抗肿瘤药物筛选模型的研究

1.3 抗肿瘤药物的类型及作用机制

1.4 粘细菌

1.5 线粒体呼吸链复合体Ⅲ抑制剂—粘噻唑

1.6 本论文的研究内容及方法

第2章 粘细菌菌株次级代谢产物的体外抑瘤作用

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

第3章 15#菌株代谢产物的提取分离

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

第4章 15#菌株代谢产物单组分的活性测定

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

第5章 菌株代谢单组分91018-1的制备和活性测定

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

第6章 91018-1（粘噻唑）对荷瘤小鼠体内抑瘤活性测定

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

第7章 15#菌株和91018菌株的系统发育分析

7.1 实验材料

7.2 实验方法

7.3 实验结果

结 语

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的科研成果