肥大细胞对布鲁菌模式识别与应答效应的体外研究

摘要

目的:
　　为研究肥大细胞对布鲁菌的模式识别与免疫应答效应,进一步阐明布鲁菌病的发病机制,为布鲁菌病的治疗和疫苗研发探索新途径与新方法。
　　方法:
　　1.分别用布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌以MOI50:1感染肥大细胞,分别在感染后1h、12h和24h时收集上清,ELISA方法测上清中IL-6、TNF-α、LT、IL-1β、组胺、类胰蛋白酶、IL-12、IFN-γ的含量,以未处理的肥大细胞为对照。
　　2.RT-PCR法检测正常肥大细胞TLR2、4、8与9 mRNA的表达。
　　3.分别用布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌以MOI50:1感染肥大细胞,在感染后1h、12h和24h时收集细胞,RT-PCR法测细胞TLR4、8与9 mRNA的表达。
　　4.用RNAi技术沉默肥大细胞TLR4,并设未沉默对照组,用RT-PCR法和流式细胞术检测其沉默效果。
　　5.分别用布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌以MOI50:1感染沉默组与未沉默组肥大细胞,分别在感染后1h、12h和24h时收集上清,ELISA方法测上清中IL-6、TNF-α、LT与组胺的含量。
　　结果:
　　1.布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌感染肥大细胞,1h、12h、24h感染组IL-6含量明显高于正常组(P<0.05),且随着感染时间的延长,IL-6含量呈增加趋势。S2菌株感染组IL-6含量与WboA-S2菌株感染组IL-6含量比较无统计学意义(P﹥0.05)。
　　2.布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌感染肥大细胞,1h感染组TNF-α含量与正常组相比无统计学意义(P﹥0.05),12h、24h各感染组TNF-α含量均高于正常组(P<0.05)。S2菌株感染组TNF-α含量与WboA-S2菌株感染组TNF-α含量比较无统计学意义(P﹥0.05)。
　　3.布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌感染肥大细胞,1h、12h、24h感染组LT含量高于正常组(P<0.05)。而且同一感染组在不同感染时间LT含量没有明显变化(P﹥0.05)。S2菌株感染组LT含量与WboA-S2菌株感染组LT含量比较无统计学意义(P﹥0.05)。
　　4.布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌感染肥大细胞,1h、12h、24h感染组组胺含量高于正常组(P<0.05)。S2菌株、大肠杆菌感染肥大细胞后组胺含量呈显先增加,再减少,然后又增加的趋势。WboA-S2菌株感染肥大细胞后1h、12h、24h组胺含量没有明显变化。24h WboA-S2菌株感染组组胺含量明显高于S2菌株感染组胺含量(P<0.05)。
　　5.在布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌感染肥大细胞的各时间点上清中均未检测到IL-1β、类胰蛋白酶、IL-12和IFN-γ。
　　6.肥大细胞表达高水平的TLR4和TLR9 mRNA,TLR8 mRNA的表达丰度较低。值得注意的是肥大细胞P815不表达TLR2。
　　7.布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌感染肥大细胞后,在12h、24h时,TLR4 mRNA的表达发生了变化。S2菌株感染肥大细胞后,TLR4 mRNA的表达随感染时间的延长逐渐增加。WboA-S2菌株感染肥大细胞后12h,TLR4 mRNA的表达减少,24h时增多。大肠杆菌感染肥大细胞后12h,TLR4 mRNA的表达显著增多,24h则减少。
　　8.布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌感染肥大细胞后,在12h、24h时,TLR9 mRNA的表达发生了变化。S2菌株感染肥大细胞后,TLR9 mRNA的表达12h时增加,24h时减少。WboA-S2菌株感染肥大细胞后,TLR9 mRNA的表达12h时无明显变化,24h表达量增加。大肠杆菌感染肥大细胞后,TLR9 mRNA的表达12h时显著减少,24h时显著增加。
　　9.布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌感染肥大细胞后,在12h、24h时TLR8 mRNA的表达没有明显变化。
　　10.确定并优化了TLR4 RNAi沉默条件:24孔板每孔加1μl转染试剂、6pmol TLR4 siRNA、1×105个肥大细胞,此条件下TLR4 mRNA和蛋白表达抑制效果最好,转染效率能达到50％。
　　11.布鲁菌S2菌株、WboA-S2菌株和大肠杆菌感染肥大细胞,TLR4 mRNA沉默组IL-6含量明显高于相应未沉默组(P<0.05),TNF-α含量和LT含量与相应未沉默组相比均无统计学意义(P﹥0.05)。
　　12.肥大细胞TLR4 mRNA沉默组的组胺含量与相应未沉默组相比有统计学意义(P<0.05)。S2菌株、大肠杆菌感染肥大细胞后,RNA沉默组组胺含量在1h时低于相应未沉默组,12h时高于相应未沉默组,24h时又低于相应未沉默组。WboA-S2菌株感染肥大细胞后,RNA沉默组组胺含量在1h时低于相应未沉默组,12h时和24h时均高于相应未沉默组。
　　结论:
　　1.布鲁菌S2菌株和WboA-S2菌株均可刺激肥大肥大细胞释放IL-6、TNF-α、LT和组胺,但不释放类胰蛋白酶、IL-1β、IL-12和IFN-γ;
　　2.WboA基因的表达产物可能是刺激肥大细胞释放组胺的主要模式配体;
　　3.肥大细胞表达高水平的TLR4和TLR9 mRNA,但TLR8 mRNA的表达丰度较低,不表达TLR2;
　　4.TLR4和TLR9参与肥大细胞对布鲁菌的识别,TLR8在识别布鲁菌中没有明显作用;
　　5.在布鲁菌刺激肥大细胞分泌IL-6和组胺的过程中,TLR4是肥大细胞的主要模式识别受体,但由于布鲁菌WboA-S2菌株与S2菌株刺激肥大细胞产生IL-6的作用相似,故推测TLR4除可识别布鲁菌的LPS外,尚可识别其他菌体成分,进而激活肥大细胞分泌IL-6。但布鲁菌激活肥大细胞分泌TNF-α和LT的过程与TLR4介导的模式识别无关。

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英文摘要

目录

第1章 综 述

第2章 实验研究

实验一 布鲁菌感染对肥大细胞的活化作用

1 前言

2 材料和仪器

3 实验方法

4 数据统计处理

5 结果

6 讨论

7 结论

实验二肥大细胞对布鲁菌的模式识别机制

1 前言

2 材料和仪器

3 实验方法

4 统计数据处理

5 结果

6 讨论

7 结论

实验三 TLR4基因的沉默对肥大细胞活化的影响

1 前言

2 材料和仪器

3 实验方法

4 统计数据处理

5 结果

6 讨论

7 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的科研成果