基于多重连接探针扩增技术(MLPA)高灵敏度检测多重microRNA

摘要

MicroRNA(miRNA)是一类内源性的非编码小分子RNA,通过与目标信使 RNA(mRNA)结合形成基因沉默复合物(RISC)调控基因的表达。MiRNA在细胞代谢、分化、免疫反应和肿瘤发生等生物过程中有重要的调控作用。许多研究表明,癌症组织中miRNA的表达异常通常与多种miRNA(一般是2-15个)有关。因此,建立一种灵敏度高、精密度好、可以同时检测多种miRNA的方法不仅在癌症的早期临床诊断和治疗方面有重要作用,对于深入了解肿瘤发生的机理也有重要的意义。
　　本文建立了一种基于多重连接探针扩增技术(MLPA)高灵敏度检测多重miRNA的方法,使用RNA碱基修饰的DNA探针,以miRNA为模板,能够被T4 RNA ligase2高效连接。利用PCR对连接的探针扩增,毛细管电泳对PCR产物进行分离检测,可检测低至0.2 fmol/L的let-7a,并且能区分miRNA序列中单个碱基的错配。我们随机选取了5种序列不相关的miRNA:mir-92a、mir-31、mir-143、mir-145和let-7a。该5种miRNA以不同长度的DNA探针进行编码,可在同一管PCR扩增反应中同时得到高灵敏度检测。将此方法进一步应用于A549细胞系(人类肺腺癌细胞株)中total RNA的miRNA检测,可以同时检测出5种目标miRNA,表明此方法能用于实际样品分析。因此,基于MLPA多重检测miRNA技术提供了一种高灵敏度、高通量检测多种miRNA的方法。

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第1章 引 言

1.1 miRNA的分析方法

1.1.1 Northern印迹法

1.1.2 微阵列芯片技术（microarray）

1.1.3 恒温指数扩增技术（IEXPAR）

1.1.4 茎环-反转录-聚合酶链式反应（stem-loop RT-PCR）

1.1.5 基于杂交反应直接定量检测多种miRNA（DQAMmiR）

1.1.6 滚环扩增技术（RCA）

1.1.7 连接酶链式反应（LCR）

1.2 多重连接探针扩增技术（MLPA）

1.3 论文主要研究内容

第2章 基于MLPA技术高灵敏度检测多重miRNA

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 仪器与试剂

2.2.2. 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 基于MLPA技术高灵敏度检测多重miRNA的原理

2.3.2 连接反应温度的优化

2.3.3 基于MLPA技术检测miRNA的校正曲线

2.3.4 基于MLPA技术检测miRNA的特异性

2.3.5 基于MLPA技术高通量检测五种miRNA

2.3.6 A549细胞系中total RNA的多重检测

2.4 本章小结

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的科研成果