免疫调节剂CH对活动期类风湿关节炎患者iNKT细胞影响的实验研究

摘要

目的：研究免疫调节剂CH1b、CH2b对健康人和活动期RA患者iNKT细胞体外增殖与功能的影响,对比CH1b、CH2b对两组iNKT细胞作用的差异；并探讨iNKT细胞对CH1b、CH2b可能的识别方式和细胞活化信号通路，为今后的临床应用提供理论依据。
　　方法：①观察免疫调节剂CH1b、CH2b体外对健康人和活动期RA患者iNKT细胞体外增殖与功能的影响。首先，收集健康人和活动期RA患者外周静脉抗凝血并分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear,PBMC)；其次，经α-半乳糖神经鞘胺醇（α-Galcer）和IL-2体外刺激扩增后，利用磁珠分选(MACS)技术分离扩增后PBMC得到纯化的恒定型自然杀伤细胞(iNKT细胞)；再次，分别与免疫调节剂CH1b、CH2b共孵育后，采用MTT法定量检测各组iNKT细胞增殖率；MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit检测相应细胞培养上清中IFN-γ/IL-4的水平；RT-PCR检测各组iNKT细胞中IFN-γmRNA与IL-4 mRNA表达水平；MTT法检测各组iNKT细胞对K562细胞的杀伤活性。
　　②探讨iNKT细胞对CH1b、CH2b可能的识别方式和细胞活化信号通路。首先，收集健康人外周静脉抗凝血并分离PBMC，经α-Galcer和IL-2体外刺激扩增后，利用MACS技术分离得到纯化的iNKT细胞；其次，分别与免疫调节剂CH1b、CH2b及相应CH的抗CD1d共孵育后，采用MTT法定量检测各组iNKT细胞增殖率；MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit检测相应细胞培养上清中IFN-γ/IL-4的水平；RT-PCR检测各组iNKT细胞中IFN-γmRNA与IL-4 mRNA表达水平；MTT法检测各组iNKT细胞对K562细胞的杀伤活性；再次，Western-Blot检测CH1组、CH2b组iNKT细胞中T-bet与GATA3表达水平，明确CH刺激iNKT细胞活化的分子机制。
　　结果：1.两组样品中单独IL-2组、CH1b组、CH2b组及空白对照组增殖均不明显（P>0.05）。与相应的对照组相比，IL-2+α-Galcer组增值率均明显升高(P<0.05)。与相应IL-2+α-Galcer组相比，健康人与活动期RA患者IL-2+CH1b组、IL-2+CH2b组iNKT细胞增值率显著提高(P<0.05)。但RA患者各组增殖率均显著低于健康人的相应对照部分(P<0.05)；与相应对照组相比，α-Galcer均能显著促进iNKT细胞IFN-γ的分泌，CH1b、CH2b能明显增加IL-4的分泌(P<0.05)，降低IFN-γ/IL-4(P<0.05)，而对IFN-γ分泌的影响未见显著性差异(P>0.05)。RA病人各组细胞因子含量虽低于相应健康人部分，但均明显高于对照组(P<0.05)；与相应的对照组相比，健康人与活动期RA患者iNKT细胞α-Galcer组IFN-γmRNA表达均明显增高(P<0.05)；CH1b组和CH2b组IL-4 mRNA的表达均明显增高(P<0.05)而IFN-γmRNA表达无显著性差异(P>0.05)；CH1b、CH2b能显著促进健康人与活动期RA患者iNKT细胞对K562细胞的杀伤活性(P<0.05)，但RA患者各组杀伤率均显著低于健康人的相应对照部分(P<0.05)。
　　2.抗CD1d组iNKT细胞增殖率、IL-4分泌、IL-4 mRNA表达、杀伤活性均低于相应CH组，与对照组相比差异不明显。提示CD1d抗体抵消了CH1b、CH2b对IL-2刺激iNKT细胞增殖的促进作用、对IL-4分泌的促进作用、对IFN-γ/IL-4的下调作用、对IL-4 mRNA表达的上调作用和对iNKT细胞杀伤活性的促进作用；与对照组相比，CH1b组和CH2b组T-bet表达差异不明显而GATA3的表达明显增高。
　　结论：1.CH1b、CH2b能促进健康人与活动期RA患者经IL-2活化的iNKT细胞体外增殖,活动期RA患者iNKT细胞存在增殖或活性低下；CH1b、CH2b能刺激健康人与RA患者iNKT细胞分泌具有明显Th2倾向的细胞因子，可能具有调节免疫紊乱和过度炎症反应的功效（CH2b更突出）；CH1b、 CH2b主要通过上调IL-4 mRNA的表达，影响iNKT细胞分泌的细胞因子，对调节活动期RA患者Th1/Th2失衡，抑制过度炎症反应具有重要意义（CH2b更为突出）；此外，CHlb、CH2b能够显著增强iNKT细胞毒活性；活动期RA患者iNKT细胞存在功能缺陷。
　　2.iNKT细胞对CH1b、CH2b的识别及功能活化可能与TCR-CD1d依赖途经相关；CH1b、CH2b有可能通过激活转录因子GATA-3通路调节iNKT分化方向，促进IL-4分泌形成TH2倾向，从而对RA个体进行定向免疫调节。因此，CH1b、CH2b是极具应用潜能的iNKT细胞激动剂，有可能成为今后开发靶向iNKT细胞的RA免疫治疗的工具。

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第一章 绪论

1.1 序言

1.2 类风湿关节炎的免疫学机制

1.3免疫细胞的特殊亚群—iNKT

1.4 iNKT细胞与RA

1.5 iNKT细胞的激动剂

1.6 研究目的与意义

参考文献

第二章 CH影响活动期RA患者iNKT细胞功能的实验研究

2.1序言

2.2 材料和方法

2.3结果

2.4讨论

参考文献

第三章 iNKT细胞对CH的识别方式及细胞活化通路

3.1 序言

3.2材料和方法

3.3结果

3.4 讨论

参考文献

第四章 结论

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文