AC3缺失对小鼠睾丸组织细胞凋亡的影响及其差异表达基因分析

摘要

环化腺苷酸（cAMP）是细胞内的一种广泛的第二信使，其在生物系统中起着广泛的作用。腺苷酸环化酶3（AC3）作为cAMP信号通路的主要成员，其功能是将ATP转化为cAMP。AC3缺失会导致cAMP信号通路的破坏，并且伴随着小鼠的嗅觉障碍、母性关爱能力下降、肥胖、学习与记忆能力下降以及雄性不育。精子的正常形成对于雄性生殖发育是必须的，并且精子的发生是一个非常严谨的产生成熟精子的过程，必须要经历细胞的有丝分裂、减数分裂和精子的形成三个重要阶段。转录因子所调控的基因在特定阶段的表达对精子的发生过程具有重要的调控作用。特别是一些重要的变化发生在精子形成的初期阶段,此阶段转录机制也是最为活跃的。并且AC3在此过程表达，通过AC3基因的失活确定其在生殖细胞发育过程中的重要性是十分必要的。但是AC3的缺失对小鼠睾丸中生精细胞发育的影响，以及会引起哪些信号通路及其调控的相关基因的表达量的变化，尚未可知。
　　本文以AC3野生型和敲除型小鼠睾丸为实验材料，首先利用TUNEL染色对小鼠睾丸组织的细胞凋亡情况进行检测，结果表明AC3缺失小鼠的睾丸中细胞的凋亡指数显著增加。随后采用基因芯片杂交的的方法，筛选AC3缺失后表达量发生变化的基因，对其进行生物信息学分析，并筛选部分基因进行实时荧光定量PCR验证和免疫荧光染色验证。结果表明，以野生型小鼠和敲除型小鼠之间差异表达倍数≥2为标准，693个基因在AC3缺失的小鼠睾丸中发生了表达改变，其中330个基因上调表达，363个基因下调表达。对所获得的693个基因进行基因功能注释和信号通路分析，注释分析结果表明，242个差异基因与分子功能相关，461个差异基因参与生物学过程，516个差异基因参与细胞组分功能。与转录活性、防御反应、细胞粘附、细胞死亡、免疫反应等功能相关的基因在AC3缺失的小鼠睾丸中都发生了表达改变。信号通路分析结果表明，AC3缺失的小鼠睾丸中差异表达基因参与的34条信号通路发生了显著性改变，包括钙离子信号通路中7个基因发生了显著性变化、嗅觉受体信号通路中28个基因发生了显著性改变、轴突向导信号通路中6个基因发生了显著性改变以及细胞连接相关的5个信号通路共25个基因发生了改变。本文选择与AC3基因功能紧密相关且表达差异较大的基因采用实时荧光定量PCR的方法验证。包括：cAMP信号通路成员calml3、olfr1016、olfr1273、olfr711；参与表观遗传调控的相关基因mettl14、dntt；参与精子运动和获能相关基因pxn、defb22、snca、dcc、itgav；细胞发育和死亡相关基因crisp1、ywhaz、irs4、olig2、cyplla1；实时荧光定量PCR结果表明，这些差异表达基因在AC3野生型和AC3敲除型小鼠睾丸内的表达趋势和芯片结果一致，同样在AC3缺失的睾丸组织内都具有显著的表达变化（P<0.05）。此外，本芯片结果还发现很多和细胞的死亡相关的基因的表达量也发生了显著性变化。本研究结果对AC3敲除雄性小鼠不育机制的了解具有非常重要的启示。

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引言

第1章 文献综述

1.1 小鼠睾丸组织

1.2 AC基因研究进展

1.3 细胞凋亡

1.4 基因芯片技术

1.5 本文研究的目的和意义

第2章 AC3缺失对小鼠睾丸组织细胞凋亡的影响

2.1 实验材料与试剂

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第3章 AC3-/-小鼠睾丸组织中差异表达基因的生物信息学分析

3.1 实验材料与仪器

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第4章 差异表达基因荧光定量PCR和免疫荧光染色验证

4.1 实验材料与试剂

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

结论

参考文献

致谢

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