中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)精子顶体反应诱导与BK通道功能初探

摘要

为了探索中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）（简称河蟹）精子大电导钙激活钾通道（简称BK通道）功能和顶体反应的关系，本研究采用副性腺蛋白溶解法获得游离中华绒螯蟹精子，以精子为试验对象，开展了以下研究，首先以Ca2+载体A23187进行精子顶体反应的体外诱导，并通过Fluo-4 AM荧光标记检测精子顶体反应前后胞内游离Ca2+浓度的变化情况。其次，采用全细胞膜片钳技术记录精子的全细胞钾电流并结合阻断剂分析钾通道的电生理特性及其类型，并模拟顶体反应时Ca2+浓度变化，观察对中华绒螯蟹精子钾电流的影响，探讨钾通道在中华绒螯蟹精子顶体反应过程中的作用规律。
　　主要研究结果如下：
　　1.以不同浓度的Ca2+载体 A23187，分别采用 ASW（artificial sea water）和 Ca2+-FASW（Calcium-free artificial sea water）配制，对精子进行顶体反应诱导，发现Ca2+载体A23187可显著提高精子的顶体反应率，且发生顶体反应的精子多处于III~IV期，最佳诱导浓度为80μg/mL，诱导时间为30 min。同时说明，Ca2+在中华绒螯蟹精子顶体反应中具有主导作用。
　　2.以 Ca2+载体 A23187诱导中华绒螯蟹精子发生顶体反应，同时采用钙荧光染料Fluo-4AM进行标记，以激光共聚焦技术追踪单个精子顶体反应发生前后胞内 Ca2+浓度的变化。研究发现，中华绒螯蟹精子未发生顶体反应前，Ca2+主要分布于细胞质和顶体囊的顶体管上，诱发精子发生顶体反应的瞬间，精子内Ca2+浓度明显升高，主要分布于细胞质和延长的顶体管前端。此外，在无钙缓冲液中，精子自身荧光并无显著增强，提示顶体反应的发生主要依赖于精子外Ca2+的内流。
　　3.以全细胞膜片钳技术记录精子全细胞钾电流，发现该电流由快速 IA样电流和延迟IK样电流组成。在无钙内液条件下，加入BK通道阻断剂IbTX（Iberiotoxin，10 nmol/L）后，IA样和IK样电流钾电流均被显著抑制，抑制幅度分别为17.74％和21.51%。提示中华绒螯蟹精子存在BK通道，部分通道可以被膜去极化激活。
　　4.在内液中加入Ca2+（50μmol/L）模拟顶体反应时Ca2+内流，发现精子IA样和IK样钾电流显著提高，提高幅度分别为61.49%和44.11%。说明Ca2+可以增强全细胞外向钾电流，加入IbTX后，IA样和IK样电流被显著抑制，抑制率分别为27.17%和22.65%。说明BK通道在精子外向钾电流中具有重要作用，而且对Ca2+具有依赖性。
　　以上研究结果表明，以Ca2+载体A23187体外诱导中华绒螯蟹精子发生顶体反应时，内流的Ca2+可激活BK通道，造成K+大量外流，改变精子膜电位，引发精子发生顶体反应。说明BK通道在中华绒螯蟹精子顶体反应中具有重要作用。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 离子通道的研究进展

1.2 膜片钳技术的发展背景及意义

1.3 精子顶体反应研究进展

1.4 研究目的及意义

第2章 Ca2+载体A23187对中华绒螯蟹精子顶体反应的诱导

2.1试验材料

2.2 仪器与试剂

2.3 试验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

第3章 中华绒螯蟹精子顶体反应前后胞内Ca2+的变化及分布

3.1试验材料

3.2仪器和试剂

3.3 试验方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论

第4章 中华绒螯蟹精子全细胞外向钾电流检测

4.1 试验材料

4.2 仪器和试剂

4.3试验方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

第5章 结语

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的科研成果