通过激活ROS诱导p53增加导致精索静脉曲张大鼠附睾与睾丸功能损伤；精子特异性阳离子通道(CatSper)与弱精子症的关系

摘要

目的： 本研究中，观察精索静脉曲张大鼠精索静脉扩张情况;通过准确称重观察精索静脉曲张大鼠附睾及睾丸体重指数;通过计算机辅助精子分析系统(computer assisted sperm analysis，CASA)检测精子浓度及精子活动率;苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE staining)观察附睾管上皮组织和睾丸曲细精管组织的变化情况;附睾组织唾液酸(sialic acid，SA)、肉毒碱和ROS含量，以及睾丸组织ROS含量通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)的方法检测;附睾及睾丸组织HIF-1α、p53的表达则通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)及免疫印迹试验(Western Blot)的方法来进行检测。研究以HIF-1α表达增加为标志的组织低氧与附睾管上皮组织及睾丸曲细精管组织变化，乃至与弱精子症发生之间的关系;分析附睾与睾丸组织中p53的表达量与ROS增加之间的关系;探讨精索静脉曲张导致的附睾及睾丸功能的损害与精子活动率之间的关系，从而寻找弱精子症可能的发病机制。 方法： 初始体重250-280克（gram，g）的健康雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠90只，由北京大学医学部实验动物科学部提供。按随机分组的方法分为手术组（30只）、假手术组（30只）和正常对照组（30只）。按照Turner的方法构建手术组实验性大鼠精索静脉曲张模型:水合氯醛腹腔麻醉成功后的大鼠以大鼠板固定，取剑突下腹部正中切口，逐层切开入腹后推开腹内容物，于左侧腹膜后显露左肾静脉，游离部分左肾静脉后，在左肾上腺静脉与下腔静脉之间的左肾静脉段放置一直径0.8毫米(millimeter，mm)的金属杆，以4-0的丝线将金属杆与左肾静脉一并结扎，结扎完成后小心抽出金属杆，此时可见左肾静脉扩张。观察左肾无明显缺血后，逐层缝合切口。假手术组模型的建立:于左侧腹膜后显露左肾静脉后，只是于左肾静脉穿线打空结，而不缩窄左肾静脉。正常对照组不作任何处理。 各组大鼠均于手术组术后49天(day,d)腹腔麻醉后取材。取材前大鼠称重，显露左侧精索静脉后以游标卡尺精确测量左精索静脉直径，左侧附睾及睾丸分别称重。应用扩散法收集左侧附睾尾部精子:切取左附睾后快速剪取左附睾尾部组织，置于37摄氏度(centigrade，℃)预热好的2毫升（milliliter，ml）生理盐水中，组织间快速剪碎，37℃恒温2分钟(minute，min)，取摇匀后的悬浊液10微升（microliter，μl）加到37℃预热好的血细胞计数板上。应用CASA按《WHO精液检查与处理实验室手册》(第五版)行精子浓度及精子活动率（前向运动+非前向运动，progressive+non-progressive，PR+NP）的检测。大鼠左附睾组织匀浆中的唾液酸、肉毒碱及ROS含量用ELISA试剂盒检测。左侧睾丸组织匀浆中ROS含量用DCFDA法的ELISA试剂盒检测。唾液酸和肉毒碱吸光度值用570纳米(nanometer，nm)波长进行测定;ROS吸光度值用510nm波长进行测定。 附睾和睾丸组织HE染色:将附睾或睾丸组织与4％多聚甲醛混合，乙醇脱水、石蜡包埋，切片，厚度为5微米(micronmeter，μm)，固定，附睾及睾丸组织切片，切片进行HE染色，然后利用乙醇脱水，二甲苯透明，放在中性树脂板材上，显微镜下观察。 结果： 实验性大鼠精索静脉曲张模型建立成功的标志:左精索静脉直径＞1mm，双肾重量无明显差别。最终成功建模:手术组27只（剔除左睾丸+左附睾萎缩1只、左睾丸+左附睾+左肾萎缩1只、左肾萎缩1只），假手术组30只，正常对照组30只。 精索静脉曲张手术组左侧精索静脉直径相较其他两组明显增粗(P=0.000＜0.001)，假手术组和对照组左侧精索静脉直径差异无显著性差异。三组大鼠体重之间无明显差异，三组大鼠左侧附睾重量之间无明显差异。精索静脉曲张手术组左侧睾丸重量相较另外两组明显减小(P=0.0012＜0.01)。精索静脉曲张手术组左侧睾丸体重指数较其他两组也是明显降低(睾丸体重指数=左侧睾丸重量/大鼠体重×100％)(P=0.001＜0.01)。 三组大鼠精子浓度经One-way ANOVA检验，无统计学意义。三组大鼠前向运动精子(PR)百分比和精子活动率（PR+NP）经One-way ANOVA检验，精索静脉曲张手术组以上两项精子活动力指标较其它两组均显著降低，差异有统计学意义(PR:P=0.000＜0.001;PR+NP:P=0.046＜0.05)。假手术组与正常对照组间两项指标无统计学意义。 经One-way ANOVA检验，手术组左侧附睾组织唾液酸和肉毒碱含量低于假手术组和正常对照组，差异有统计学意义(唾液酸:P=0.007＜0.01;肉毒碱:P=0.008＜0.01);手术组左侧附睾组织ROS含量高于假手术组和正常对照组，差异有统计学意义(P=0.000＜0.001)。精索静脉曲张手术组大鼠左侧睾丸组织ROS含量较另外两组明显增高(P=0.000＜0.001)。假手术组与正常对照组间两项指标无统计学意义。 HE染色观察发现:精索静脉曲张手术组曲张侧附睾管上皮细胞及睾丸曲细精管上皮细胞数量明显少于正常对照组和假手术组，精索静脉曲张手术组曲张侧附睾管上皮细胞及睾丸曲细精管上皮细胞排列相对于对照组与假手术组明显疏松无序，并伴有空泡样变性。 免疫组织化学:根据HIF-1α表达量的评分标准，手术组大鼠附睾和睾丸组织HIF-1α表达阳性率明显高于正常对照组和假手术组(P=0.000＜0.0001)，而正常对照组和假手术组之间比较没有统计学差异。手术组大鼠附睾和睾丸组织p53表达阳性率明显高于另外两组(P=0.000＜0.0001)，而对照组和假手术组之间比较没有统计学差异。 免疫印迹试验:以HIF-1α的灰度值与相应内参灰度值的比值作为HIF-1α的相对表达量。免疫印迹试验结果表明精索静脉曲张手术组左侧附睾和睾丸HIF-1α蛋白相较假手术组和正常对照组明显增高(P=0.000＜0.001)。假手术组与正常对照组中的表达差异无统计学意义。以p53的灰度值与相应内参灰度值的比值作为p53的相对表达量。免疫印迹结果表明手术组左侧附睾和睾丸组织p53蛋白和假手术组及正常对照组表达显著增高(P=0.000＜0.001)。假手术组与正常对照组中的表达差异无统计学意义。 直线回归分析发现:精索静脉曲张手术组左侧睾丸组织ROS含量与相应的p53条带的相对表达量呈显著正相关(P=0.041＜0.05;r=0.387)。三组大鼠左侧睾丸组织ROS含量与相应的p53条带的相对表达量也呈显著正相关(P=0.000＜0.001;r=0.618)。 结论： 1.精索静脉曲张导致以HIF-1α表达明显增加为标志的附睾及睾丸组织低氧。 2.精索静脉曲张会导致以附睾组织唾液酸及肉毒碱含量降低为标志的附睾功能的损害。 3.低氧环境导致附睾及睾丸组织ROS的堆积增加，促使附睾和睾丸组织内p53表达异常增加。 4.附睾和睾丸组织内p53表达异常增加，诱导附睾管上皮和睾丸曲细精管上皮细胞大量凋亡，从而导致附睾和睾丸功能的损害，进而影响精子的成熟和获得前向运动的能力，导致精子活动力的降低。

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通过激ROS诱导p53增加导致精索静脉曲张大鼠附睾与睾丸功能损伤

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

图表

参考文献

精子特异性阳离子通道(CatSper)与弱精子症的关系

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前言

研究对象与研究方法

结果

讨论

结论

图表

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